人巨細(xì)胞病毒（HCMV）是全球范圍內(nèi)普遍感染的一種皰疹病毒,也是引起胎兒先天性畸形和器官移植受者死亡最常見(jiàn)的病原體。有研究表明,gH蛋白是HCMV主要的中和性抗原,特異性抗gH抗體具有中和HCMV及阻斷病毒在細(xì)胞間傳播的潛力。本研究以含人巨細(xì)胞病毒臨床株Toledo全基因組的細(xì)菌人工染色體（BAC）為模板,擴(kuò)增去除信號(hào)肽和跨膜區(qū)的gH基因片段,并將其插入表達(dá)載體構(gòu)建pET32a’-gH重組表達(dá)質(zhì)粒,將序列鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株TransB,誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。用純化的重組gH蛋白免疫8周齡BALB/c雄鼠,經(jīng)雜交瘤技術(shù)獲得5株穩(wěn)定分泌抗gH單克隆抗體的細(xì)胞株,分別命名為8A9、8B4、8C4、8D9、8D12。所獲5株單克隆抗體對(duì)gH蛋白均具有良好的反應(yīng)性,其中8A9、8B4、8D9和8D12具有一定的病毒捕獲能力,且8D9和8D12的捕獲能力較強(qiáng)。本研究獲得了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗gH單克隆抗體,抗體具有良好的病毒捕獲能力。在此基礎(chǔ)上,我們將進(jìn)一步鑒定其是否為中和抗體,為今后開(kāi)發(fā)治療HCMV感染的中和抗體奠定基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：激光生物學(xué)報(bào). 2020,29(03)

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a"-gH的構(gòu)建

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TransB菌株，并用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。分別留取IPTG誘導(dǎo)前后的蛋白樣，并通過(guò)SDS-PAGE、WB鑒定蛋白表達(dá)情況。SDS-PAGE結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的重組菌株表達(dá)了一個(gè)約70 kD的蛋白(圖2a)。為驗(yàn)證誘導(dǎo)表達(dá)蛋白是否為gH蛋白，我們以抗6×His-tag抗體作為一抗，使用WB對(duì)重組蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)菌株在70 kD處出現(xiàn)了特異性條帶，而對(duì)照菌株中沒(méi)有出現(xiàn)(圖2b)，提示菌株所表達(dá)的70 kD蛋白處為含有6×Histag的重組蛋白。超聲波破碎后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組表達(dá)菌株，SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組蛋白主要存在于沉淀中，說(shuō)明該蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)(圖2a)。使用WB對(duì)重組蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，與SDS-PAGE結(jié)果一致(圖2b)。大量表達(dá)gH，收集沉淀，后者經(jīng)洗滌、尿素變性后，用電洗脫方法進(jìn)行純化，收集純化前后的蛋白樣，并通過(guò)SDS-PAGE和WB鑒定gH純化情況(圖3)。結(jié)果顯示:與純化前相比，純化后gH僅有1條較亮的條帶，gH重組蛋白純化率達(dá)90%以上，達(dá)到免疫小鼠制備單克隆抗體的要求。圖3 重組gH蛋白的純化鑒定

重組gH蛋白的純化鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]寨卡病毒NS1蛋白的原核表達(dá)和單克隆抗體的制備[J]. 趙亭亭,徐葉,廖旻晶,劉如石,李曉丹.  中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào). 2019(03)
[2]人巨細(xì)胞病毒pp65蛋白的原核表達(dá)及活性鑒定[J]. 許鳳,邱義蘭,邱果,李桑,何賽,鄭姣,李小曼,劉如石.  生命科學(xué)研究. 2013(04)
[3]人巨細(xì)胞病毒包膜糖蛋白gB、gH結(jié)構(gòu)、分型及生物學(xué)活性[J]. 王曉燕,彭慧琴.  中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志. 2008(10)
[4]鴨瘟病毒囊膜糖蛋白gH的原核表達(dá)和免疫印跡[J]. 金映紅,冉多良,葉偉成,王一成,袁秀芳,盧立志,陳方華,張存.  浙江農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(03)
[5]信號(hào)肽去除的耐熱堿性磷酸酯酶FD-TAP在大腸桿菌中的亞克隆和高表達(dá)[J]. 季朝能,白曉陽(yáng),盛小禹,張冰,毛裕民.  生物工程學(xué)報(bào). 2000(06)



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