降鈣素原（procalcitonin,PCT）是目前公認(rèn)的炎性標(biāo)志物,在感染性疾病的鑒別診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷等方面有重要價(jià)值。免疫熒光和電化學(xué)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了對(duì)PCT的定量、快速檢測(cè)。目前PCT的檢測(cè)試劑盒均基于抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng),其抗原和抗體均來源于進(jìn)口廠商。制備穩(wěn)定的抗原和高特異性的單克隆抗體是實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化產(chǎn)品的基礎(chǔ)。目的:原核表達(dá)人降鈣素原重組蛋白,優(yōu)化蛋白表達(dá)條件;制備高純度的PCT單克隆抗體并對(duì)其進(jìn)行鑒定;建立PCT熒光免疫層析方法,對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)以評(píng)估性能。方法:將構(gòu)建的重組表達(dá)菌株E.coli BL21（含PCT-pET22b（+））活化,誘導(dǎo)表達(dá)PCT蛋白,優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的濃度。用Ni-NTA親和層析法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,蛋白印跡法和膠體金法對(duì)其進(jìn)行鑒定。獲得的PCT重組蛋白與佐劑充分研磨乳化,采用長(zhǎng)程免疫法皮下多點(diǎn)注射Balb/c小鼠,4次免疫后檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。達(dá)到融合條件后,取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）進(jìn)行融合,間接ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株并進(jìn)行亞克隆3⁴次。將單克隆細(xì)胞株注入小鼠腹腔刺激產(chǎn)生腹水,... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

降鈣素原氨基酸序列圖

撲卦?タ寺】固宓鬧票訃捌溆?餉庖卟鬮齜ǖ某醪窖芯?20圖2.1 重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物分析M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1：裂菌后沉淀；2：裂菌后上清；Fig 2.1 Analysis of expression products of recombinant strainsM：Protein marker；1：Precipitation after splitting；2：Supernatant after splitting2.3.2 IPTG 誘導(dǎo) PCT 蛋白表達(dá)的優(yōu)化設(shè)置不同 IPTG 誘導(dǎo)濃度觀察目的蛋白的表達(dá)量，分別將樣本進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)果顯示：在 IPTG 終濃度為 0.8mmol/L 時(shí)蛋白的表達(dá)量達(dá)到最高（圖 2.2）。圖2.2 誘導(dǎo)劑IPTG濃度優(yōu)化M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1~5：誘導(dǎo)劑 IPTG 終濃度 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1

SDS-PAGE 電泳，結(jié)果顯示：在 IPTG 終濃度為 0.8mmol/L 時(shí)蛋白的表達(dá)量達(dá)到最高（圖 2.2）。圖2.2 誘導(dǎo)劑IPTG濃度優(yōu)化M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1~5：誘導(dǎo)劑 IPTG 終濃度 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/LFig 2.2 Optimization of IPTG concentrationM：Protein marker；1~5 ：Final concentration of IPTG 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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