目的探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)蛋白（TGFBI）基因調(diào)控人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（huc-MSC）的成骨分化作用。方法培養(yǎng)huc-MSC,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105,油紅O染色和堿性磷酸酶（ALP）染色檢測(cè)體外成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力,實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q-PCR）檢測(cè)成脂和成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。采用si-RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低huc-MSC的TGFBI基因,并研究其對(duì)huc-MSC生物學(xué)特性的影響;進(jìn)一步利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定敲低TGFBI基因的huc-MSC(TGFBI^-/-huc-MSC),并對(duì)TGFBI^-/--hucMSC進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化,ALP染色鑒定細(xì)胞ALP活性,q-PCR檢測(cè)成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ALP及骨橋蛋白（OPN）的表達(dá)差異。結(jié)果培養(yǎng)的huc-MSC表達(dá)MSC表面標(biāo)志物CD14^-CD34^-CD45^-CD73⁺CD90⁺CD105^+... 

【文章來(lái)源】：軍事醫(yī)學(xué). 2020,44(01)北大核心

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TGFBI-/-huc‐MSChuc‐MSC的生物學(xué)特性檢測(cè)A.qPCR檢測(cè)TGFBI基因mRNA水平的表達(dá)；B.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)（標(biāo)尺=400μm）；C.Giemsa染色，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)為成纖維狀，貼壁生長(zhǎng)（標(biāo)尺=400μm）；D.流式細(xì)胞術(shù)分析

軍事醫(yī)學(xué)2020年1月第44卷第1期MilMedSci，Vol44，No1，Jan，2020圖3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA‐TGFBIRNA‐TGFBI后MSC成骨誘導(dǎo)分化能力的改變A，B.ALP染色檢測(cè)hucMSC成骨誘導(dǎo)自分化組及誘導(dǎo)組（標(biāo)尺=400μm）；C，D.ALP染色檢測(cè)TGFBI-/-hucMSC成骨誘導(dǎo)自分化組及誘導(dǎo)組（標(biāo)尺=400μm）；E.qPCR檢測(cè)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)；***P<0.001圖4篩選慢病毒TGFBI‐RNAiGFBI‐RNAi穩(wěn)定敲低huc‐MSC中TGFBI基因A~C.熒光顯微鏡下觀察慢病毒載體轉(zhuǎn)染后GFP表達(dá)（標(biāo)尺=400μm）；D，E.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染效率及統(tǒng)計(jì)結(jié)果；F.qPCR檢測(cè)TGFBI基因mRNA水平的表達(dá)；xˉ±s，n=3，*P<0.05，***P<0.001，與對(duì)照組相比26

胞成骨誘導(dǎo)后ALP活性較hucMSC明顯增強(qiáng)（圖5），這與上述結(jié)果一致，提示TGFBI抑制hucMSC成骨分化。為進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)果，qPCR檢測(cè)hucMSC和TGFBI-/-hucMSC的成骨誘導(dǎo)分化后成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物ALP和OPN的表達(dá)。結(jié)果顯示，與hucMSC成骨誘導(dǎo)組相比，TGFBI/-hucMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后，ALP和OPN的表達(dá)均顯著增高（P<0.001，圖6），表明TGFBI抑制hucMSC成骨分化過(guò)程的ALP、OPN表達(dá)。以上結(jié)果證實(shí)TGFBI可抑制hucMSC成骨分化。圖5ALPALP染色法檢測(cè)TGFBI-/-huc‐MSChuc‐MSC成骨誘導(dǎo)分化A，B.ALP染色檢測(cè)hucMSC成骨誘導(dǎo)自分化組及誘導(dǎo)組（標(biāo)尺=400μm）；C，D.ALP染色檢測(cè)TGFBI-/-hucMSC成骨誘導(dǎo)自分化組及誘導(dǎo)組（標(biāo)尺=400μm）圖6q‐PCRq‐PCR檢測(cè)TGFBI-/-huc‐MSChuc‐MSC成骨誘導(dǎo)分化能力***P<0.0013討論MSC是來(lái)源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，作為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的種子細(xì)胞，被廣泛研究和應(yīng)用。以往研究結(jié)果表明，MSC具有分化可塑性，在不同微環(huán)境中可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，用于修復(fù)損傷或維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。MSC分化微環(huán)境是由多種細(xì)胞外基質(zhì)成分、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及趨化因子組成，這些成分能啟動(dòng)特定的信號(hào)通路及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，活化的信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)PPARγ和C/EBP［16］或Runx2和Osterix［17］來(lái)調(diào)控MSC的成脂與成骨分化平衡，且這種穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)機(jī)體生理過(guò)程至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，許多疾病的發(fā)生是由于體內(nèi)MSC向成脂、成骨分化失衡所致［18］，如成骨細(xì)胞減少所致的骨髓成脂?


本文編號(hào)：3422054