H7N9流感病毒已在一些國家和地區(qū)傳播[1,3]。人感染H7N9禽流感病毒后死亡率高達30%。研究發(fā)現(xiàn),病毒對人呼吸道上皮細胞主要受體α-2,6-唾液酸的親和力不斷增加[4.5],且部分毒株對現(xiàn)行的抗病毒藥物已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性[4,6-8],WHO將H7N9禽流感病毒列為潛在的大流行流感病毒[7]。因此,研制人用H7N9禽流感疫苗具有重要戰(zhàn)略意義。目前國內(nèi)流感疫苗生產(chǎn)用病毒種子批均是從國外獲得,如果將高致病禽流感病毒H7N9改造成疫苗株再返回國內(nèi)用于疫苗生產(chǎn),則我們很可能會錯過防控流感大流行的最佳時機。此外,大多數(shù)現(xiàn)行流感疫苗基本是采用雞胚生產(chǎn),雞胚供應(yīng)周期長,尤其是當(dāng)高致病性禽流感爆發(fā)時,種雞有可能感染病毒死亡進而加劇雞胚供應(yīng)不足,造成疫苗生產(chǎn)困難。與雞胚相比,非洲綠源猴腎細胞（Vero）可以采用發(fā)酵罐培養(yǎng),易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和質(zhì)量控制且具有較高安全性,適合用于疫苗生產(chǎn)。但流感病毒流行株在Vero細胞上產(chǎn)量不穩(wěn)定,阻礙Vero細胞流感疫苗的研發(fā)[9,10]。因此,我們開展研究,通過解決流感病毒在Vero細胞上產(chǎn)量不穩(wěn)定問題研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的Vero細胞H7N9大流行流感疫苗。首先,... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１反向遺傳學(xué)拯救病毒技術(shù)路線圖??

３．１．２含流感病毒基因組載體構(gòu)建??將酶切過后的經(jīng)過膠回收的空載ｐＨＷ２０００載體使用１?％濃度的瓊脂糖凝膠進行??鑒定，如圖１．３中所示，自然狀態(tài)下ＤＮＡ存在超螺旋，開環(huán)，環(huán)狀三種狀態(tài)。鏈??狀ＤＮＡ在相同的電泳環(huán)境中移動速度較環(huán)狀ＤＮＡ慢，環(huán)狀ＤＮＡ較超螺旋ＤＮＡ??慢。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶切割的鏈狀ＤＮＡ為單一的條帶，與陰性（未切割）的質(zhì)粒??相比（圖中條帶較暗），酶切后的載體條帶位置發(fā)生變化，比較靠近電泳起始的位??置，與自然狀態(tài)下的開環(huán)質(zhì)粒在此電泳圖中的位置相似，證明空載ＰＨＷ２０００質(zhì)粒??切割完全。??１８??

２９３Ｔ細胞是經(jīng)改造后能夠表達ＳＶ４０大Ｔ抗原的人胚腎上皮細胞，目前被廣泛??用于轉(zhuǎn)染表達各種目標(biāo)蛋白或者是包裝各類病毒。轉(zhuǎn)染前，鋪設(shè)的６孔板孔內(nèi)細胞??經(jīng)過１６小時的培養(yǎng)，生長到４０％－６０％的狀態(tài)，如圖１．４Ａ，選�。龋罚危共《荆龋�、??ＮＡ多份質(zhì)粒進行組合（如表１．７）轉(zhuǎn)染２９３Ｔ細胞，轉(zhuǎn)染后在３７°Ｃ，?５％Ｃ０２培養(yǎng)箱??培養(yǎng)。觀察細胞發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后２４小時密度增加到約８０％?（圖１．４Ｂ），轉(zhuǎn)染后４８小時??候細胞長滿密集單層（圖１．４Ｃ）。轉(zhuǎn)染后７２小時對轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)液進行收獲，此??時細胞培養(yǎng)液顏色變淺，部分細胞已經(jīng)出現(xiàn)漂浮。??１９??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]ELISA法檢測H3N2亞型流感病毒Vero細胞適應(yīng)株[J]. 盧勇,宋紹輝,蔡瑋,馬磊,吳雅楠,李衛(wèi)東,廖國陽.  現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展. 2013(10)
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博士論文
[1]微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細胞和甲型流感病毒制備流感滅活疫苗的研究[D]. 周健.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 2017

碩士論文
[1]流感病毒H3N2亞型Vero細胞適應(yīng)株基因克隆及相關(guān)基因突變位點分析[D]. 羅振武.中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 2008



本文編號：3409943