目的表達(dá)及純化肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）菌毛FimA蛋白并制備多克隆抗體。方法在Clustal Omega網(wǎng)站上比對(duì)不同細(xì)菌FimA蛋白的同源性。設(shè)計(jì)特異引物,PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯菌FimA基因,雙酶切后將其連接到表達(dá)質(zhì)粒pET28a,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-FimA。將pET28a-FimA轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21 star（DE3）后培養(yǎng),使用IPTG誘導(dǎo)FimA蛋白表達(dá)。使用IEDG在線網(wǎng)站分析FimA蛋白的B細(xì)胞表位,然后用層析純化的重組FimA蛋白免疫小鼠,獲得免疫血清,ELISA檢測(cè)IgG、IgG1、IgG2a和IgA。結(jié)果肺炎克雷伯菌的FimA與其他FimA蛋白同源性較低,為23.6%～30.6%。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-FimA在大腸埃希菌中能表達(dá)21.6×10³的重組FimA蛋白,經(jīng)親和層析后得到單一電泳條帶的高純度目的蛋白。用FimA蛋白免疫小鼠,獲得高滴度的IgG和IgA,且IgG2a的A₄₅₀值高于IgG1。結(jié)論成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET28a-FimA,獲得高純度的重組蛋白FimA。Fi... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2020,15(01)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

不同細(xì)菌的FimA蛋白氨基酸序列比較

提取肺炎克雷伯菌基因組DNA,使用特異性引物PCR擴(kuò)增得到約為570 bp的FimA基因片段(圖2)�；厥誇imA基因PCR產(chǎn)物,使用NdeI和HindIII雙酶切后與同樣酶切的pET28a連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。經(jīng)PCR和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒pET28a-FimA構(gòu)建正確(圖2)。3 重組FimA蛋白的表達(dá)及純化

使用IEBD在線網(wǎng)站分析FimA蛋白的B細(xì)胞表位,有5處可能形成表位(圖4),其氨基酸序列和在蛋白中的位置見(jiàn)表1。圖4 IEBD預(yù)測(cè)FimA蛋白的B細(xì)胞表位

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]血流感染高致病性肺炎克雷伯菌毒力因子及分子分型特點(diǎn)分析[J]. 林佛君,胥志超,林志偉,鄭金鑫,陳重,程航,徐廣健,韓雪瑩,張波,余治健,鄧啟文.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2018(04)
[2]肺炎克雷伯菌菌毛的研究進(jìn)展[J]. 王歡歡,宋超,何海洋,林吾燁,劉新.  中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志. 2015(12)



本文編號(hào)：3380936