目的:通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除自閉癥風(fēng)險(xiǎn)基因katnal2,建立穩(wěn)定的katnal2基因突變的斑馬魚模型,通過(guò)斑馬魚突變模型研究katnal2基因?qū)Πl(fā)育的影響。方法:通過(guò)整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)及qPCR實(shí)驗(yàn)觀察斑馬魚katnal2基因在早期發(fā)育階段的時(shí)空表達(dá)譜。通過(guò)斑馬魚的katnal2基因信息,設(shè)計(jì)合適的靶位點(diǎn),制備相應(yīng)的gRNA和有效的Cas9 m RNA。采用斑馬魚胚胎顯微注射技術(shù)將gRNA和Cas9 m RNA的混合體系注射入單細(xì)胞胚胎卵黃中,48hpf后通過(guò)T7E1酶切及Sanger測(cè)序檢測(cè)gRNA的打靶有效性。使用Sanger測(cè)序篩選出F1代斑馬魚突變體,采用genotyping-PCR反應(yīng)篩選F2代純合突變體,并通過(guò)qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)katnal2基因敲除后的表達(dá)情況。在顯微鏡下觀察野生型及F3代斑馬魚純合突變體胚胎的早期發(fā)育狀態(tài)并在5dpf時(shí)測(cè)量其幼魚的體長(zhǎng)進(jìn)行比較分析,再對(duì)6dpf的幼魚進(jìn)行明暗刺激實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:qPCR和原位雜交結(jié)果顯示katnal2在早期發(fā)育階段表達(dá)量低,24 hpf之前全身表達(dá),24 hpf之后主要在腦部表達(dá)。T7E1酶切和Sanger測(cè)序的結(jié)果... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

katnal2突變自閉癥患者突變信息

圖 2：斑馬魚 katnal2 基因的結(jié)構(gòu)信息。斑馬魚 katnal2 基因有 14 個(gè)外顯子，只有一種轉(zhuǎn)錄本，蛋白上的主要結(jié)構(gòu)域是 LisH 和 AAA 結(jié)構(gòu)域。1.3 斑馬魚作為模式生物在社會(huì)神經(jīng)生物學(xué)研究中，斑馬魚正在迅速成為介于體外研究和哺乳動(dòng)物體內(nèi)研究的新型有效模型。經(jīng)過(guò)多年的研究應(yīng)用及發(fā)展，約有 20 個(gè)斑馬魚品系，目前最常見的為 AB 品系和 Tubingen 品系，且在專門的斑馬魚信息數(shù)據(jù)庫(kù) ZFIN

圖 3 CRISPR/Cas9 體系電泳圖。 A: gRNA1 和 gRNA2 體外轉(zhuǎn)錄模板；B: Cas9 mRNA 及gRNA1 和 gRNA2 體外轉(zhuǎn)錄后獲得的 RNA。3.1.3 獲得 CRISPR/Cas9 混合體系分別將獲得的 katnal2 特異性 gRNA1 和 gRNA2 與 Cas9 mRNA 以一定比例混合，使得 gRNA 和 Cas9 mRNA 的終濃度分別為 40 ng/ L 和 300 ng/ L,以便用于單細(xì)胞期胚胎顯微注射。3.2 F0 代斑馬魚胚胎突變有效性鑒定分別隨機(jī)挑取注射組及對(duì)照組的胚胎提取基因組 DNA 進(jìn)行突變驗(yàn)證，驗(yàn)證的方法主要有對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 T7E1 酶切和將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 Sanger 測(cè)序。用于擴(kuò)增靶序列靶向位置所在區(qū)域 DNA 片段的引物序列如下所示：Katnal2_cp1_check_F 5'-GCGTATTTCTTCCCGTTTGC-3'


本文編號(hào)：3338203