本文關(guān)鍵詞：SIRT1的選擇性剪接在衰老過程中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：衰老是生物體內(nèi)發(fā)生的漸進(jìn)性多器官、多層次、多方面的復(fù)雜變化過程,其后果是機(jī)體功能的衰退或失調(diào)。機(jī)體衰老的基礎(chǔ)是細(xì)胞的衰老,這一過程受遺傳和環(huán)境因素的共同調(diào)節(jié)。目前,雖然有多種學(xué)說從不同方面解釋衰老的發(fā)生,但其關(guān)鍵機(jī)制以及調(diào)控方式仍不明確。沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源物1(Silent mating type information regulation2 homolog1,SIRT1)是一個(gè)NAD+依賴的組蛋白脫乙酰基酶,經(jīng)其去乙�；饔糜绊慞53,P16,FOXO,NF-κB,和PGC-1α等不同的下游分子,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的衰老、程序性死亡、新陳代謝等不同過程進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在熱量限制(Caloric restriction,CR)引起的生命周期的延長(zhǎng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,從而引發(fā)了研究者的廣泛興趣。在體外,SIRT1能夠抑制氧化應(yīng)激和高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞以及干細(xì)胞的衰老;在嚙齒類動(dòng)物的相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn),SIRT1在衰老過程以及年齡依賴的器官功能下降中發(fā)揮重要作用。然而SIRT1對(duì)部分下游分子,甚至生理或病理進(jìn)程的作用研究常常存在相互矛盾的報(bào)道。這提示SIRT1的功能可能存在更加復(fù)雜的機(jī)制和調(diào)控因素。SIRT1的序列高度保守,且長(zhǎng)期被認(rèn)為不存在剪接變異體。但2010年Lynch等的研究顯示人類及小鼠的SIRT1 pre-m RNA存在選擇性剪接,即產(chǎn)生缺失第八外顯子的SIRT1(SIRT1-ΔExon8)和SIRT1全長(zhǎng)(SIRT1-FL)兩種變異體。新近研究發(fā)現(xiàn),SIRT1-ΔExon8的生物學(xué)作用及調(diào)控機(jī)制與SIRT1-FL存在較大差異。在前期的實(shí)驗(yàn)過程中,我們發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)可能也存在SIRT1的選擇性剪接,由于大鼠與人和小鼠的SIRT1結(jié)構(gòu)不同,后者具有9個(gè)外顯子,而大鼠具有8個(gè)外顯子,因此其產(chǎn)生的選擇性變異體也不同。實(shí)驗(yàn)顯示,大鼠可能產(chǎn)生與小鼠或人SIRT1-ΔExon8的生物學(xué)作用與調(diào)控機(jī)制相似的缺失第七外顯子的SIRT1(SIRT1-ΔExon7)。已知SIRT1在衰老進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用,但其剪接變異體是否影響衰老進(jìn)程目前尚無(wú)報(bào)道。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用衰老的細(xì)胞模型和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠的選擇性剪接,以及觀察大鼠SIRT1的選擇性剪接在衰老過程可能發(fā)揮的作用。第一部分SIRT1-ΔExon8在D-半乳糖誘導(dǎo)的293T細(xì)胞衰老模型中的作用觀察目的:通過觀察缺失第八外顯子的SIRT1選擇性剪接變異體(SIRT1-ΔExon8)在D-半乳糖(D-gal)誘導(dǎo)的293T細(xì)胞衰老模型中的表達(dá)變化,初步探討SIRT1-ΔExon8對(duì)細(xì)胞衰老進(jìn)程的影響。方法:1.CCK8法測(cè)定不同濃度D-半乳糖(0,5,10,15,20 g/L)對(duì)293T細(xì)胞活力的影響。2.選取終濃度為10 g/L的D-半乳糖DMEM高糖培養(yǎng)基作用于第3代293T細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)至第6代,建立細(xì)胞衰老模型,應(yīng)用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色方法觀察衰老細(xì)胞的陽(yáng)性率。3.RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)組與對(duì)照組細(xì)胞中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon8 m RNA的表達(dá)水平。結(jié)果:1.CCK-8結(jié)果顯示10 g/L的D-半乳糖培養(yǎng)基能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老且不引起細(xì)胞過度損傷。2.誘導(dǎo)組衰老細(xì)胞陽(yáng)性率74.25±3.62%高于對(duì)照組7.68±1.43%(P0.05)。3.RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)組SIRT1-FL和SIRT1-ΔExon8 m RNA表達(dá)水平分別較對(duì)照組降低了78.26±5.16%和88.03±3.27%(P0.05)。小結(jié):1.SA-β-gal染色結(jié)果提示D-半乳糖誘導(dǎo)的293T細(xì)胞衰老模型建立成功。2.衰老細(xì)胞組的SIRT1-FL以及SIRT1-ΔExon8 m RNA表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著降低,提示SIRT1-FL和SIRT1-ΔExon8可能參與調(diào)控細(xì)胞衰老進(jìn)程。第二部分SIRT1-ΔExon7在大鼠衰老過程中的表達(dá)改變及意義目的:證實(shí)大鼠海馬組織中存在SIRT1的選擇性剪接變異體;觀察SIRT1全長(zhǎng)及缺失第七外顯子的SIRT1選擇性剪接變異體(SIRT1-ΔExon7)在不同年齡段大鼠海馬組織中表達(dá)變化,從而初步探討SIRT1全長(zhǎng)及SIRT1-ΔExon7在衰老進(jìn)程中的表達(dá)改變。方法:1.通過PCR產(chǎn)物的凝膠電泳及c DNA測(cè)序檢測(cè)擴(kuò)增目的基因是否為SIRT1-ΔExon7。2.將不同日齡(P7,P90,P720)大鼠海馬組織進(jìn)行冰凍切片,并應(yīng)用SA-β-gal染色并觀察細(xì)胞衰老陽(yáng)性率。3.RT-PCR測(cè)定不同年齡段大鼠海馬組織中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon7 m RNA的表達(dá)水平。結(jié)果:1.瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序結(jié)果顯示,大鼠海馬組織存在SIRT1-ΔExon7的表達(dá)。2.SA-β-gal染色結(jié)果顯示新生鼠偶見SA-β-gal陽(yáng)性衰老細(xì)胞,而老年大鼠可見大量胞漿呈淡藍(lán)色的SA-β-gal陽(yáng)性衰老細(xì)胞,提示隨年齡增加大鼠腦內(nèi)細(xì)胞的SA-β-gal活性逐漸增強(qiáng),衰老細(xì)胞呈年齡依賴性遞增趨勢(shì)。3.RT-PCR結(jié)果顯示P90組及P720組SIRT1-FL m RNA表達(dá)水平與P7組相比均無(wú)明顯差異;而SIRT1-ΔExon7 m RNA表達(dá)水平分別升高了77.40±7.38%和89.28±9.23%(P0.05)。小結(jié):1.大鼠體內(nèi)存在缺失第7外顯子的SIRT1選擇性剪接變異體。2.SIRT1-ΔExon7在衰老海馬組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。第三部分SIRT1-ΔExon7在誘導(dǎo)大鼠MSCs衰老細(xì)胞中的表達(dá)變化及意義目的:為了更進(jìn)一步研究SIRT1以及SIRT-Δ7在衰老過程的作用,我們采用誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)衰老細(xì)胞模型,觀察SIRT-Δ7在細(xì)胞衰老過程中的表達(dá)變化。方法:1.將MSCs細(xì)胞反復(fù)傳代至第18代,β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色觀察衰老細(xì)胞陽(yáng)性率。2.RT-PCR檢測(cè)衰老組與對(duì)照組細(xì)胞中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon7 m RNA的表達(dá)水平。結(jié)果:1.隨著細(xì)胞不斷傳代SA-β-gal陽(yáng)性衰老細(xì)胞增加,衰老組細(xì)胞陽(yáng)性率57.64%±7.39%明顯高于對(duì)照組16.35%±2.17%(P0.05)。2.RT-PCR結(jié)果顯示衰老組SIRT1-FL m RNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了20.09±2.74%(P0.05);和SIRT1-ΔExon7m RNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了132.85±11.07%(P0.05)。小結(jié):衰老細(xì)胞中SIRT1-ΔExon7表達(dá)顯著升高,提示SIRT1-ΔExon7可能在衰老過程發(fā)揮作用。結(jié)論:1.首次證實(shí)大鼠存在SIRT1的選擇性剪接,形成選擇性變異體SIRT1-ΔExon7,而不是之前報(bào)道的SIRT1-ΔExon8。2.整體動(dòng)物及離體實(shí)驗(yàn)(兩種來(lái)源的細(xì)胞)均觀察到衰老過程中SIRT1-ΔExon7表達(dá)水平的改變,提示SIRT1的選擇性剪接可能在衰老進(jìn)程發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：衰老 SIRT1 選擇性剪接 SIRT1-ΔExon8 SIRT1-ΔExon7 大鼠
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R339.38
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 常用縮寫詞中英文對(duì)照表14-15
• 前言15-17
• 第一部分 SIRT1-ΔExon8在D-半乳糖誘導(dǎo)的293T細(xì)胞衰老模型中的作用觀察17-27
• 1 材料與方法17-23
• 1.1 材料和試劑17-19
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法19-22
• 1.3 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理22-23
• 2 結(jié)果23-25
• 2.1 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力23
• 2.2 衰老相關(guān)的SA-β-gal染色23-24
• 2.3 RT-PCR檢測(cè)SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon8 的mRNA含量24-25
• 3 討論25-27
• 第二部分 SIRT1-ΔExon7 在大鼠衰老過程中的表達(dá)改變及意義27-35
• 1 材料與方法27-30
• 1.1 材料和試劑27-29
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法29
• 1.3 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理29-30
• 2 結(jié)果30-33
• 2.1 大鼠缺失第七外顯子SIRT1 mRNA的鑒定30-31
• 2.2 衰老相關(guān)SA-β-gal染色31
• 2.3 缺失第7外顯子的SIRT1 在衰老組的表達(dá)發(fā)生改變31-33
• 3 討論33-35
• 第三部分 SIRT1-ΔExon7 在誘導(dǎo)大鼠MSCs衰老細(xì)胞中的表達(dá)變化及意義35-43
• 1 材料與方法35-39
• 1.1 材料和試劑35-37
• 1.2.實(shí)驗(yàn)方法37
• 1.3 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理37-39
• 2 結(jié)果39-41
• 2.1 衰老相關(guān)SA-β-gal染色39
• 2.2 SYBR Green Real-time PCR39-41
• 3 討論41-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 綜述48-53
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 致謝53-54
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果54-55
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷55

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1 王s

本文編號(hào)：328719