基于掃描電化學(xué)顯微鏡（SECM）產(chǎn)生收集模式,開展小鼠免疫球蛋白IgG（作為抗原）檢測研究.利用分子自組裝的方式,以硫辛酸為媒介,利用金與硫的鍵合作用以及羧基與氨基的化學(xué)反應(yīng)將羊抗鼠抗體修飾在金電極上,辣根過氧化氫酶（HRP）標(biāo)記的小鼠抗原與未標(biāo)記的小鼠抗原再通過競爭與有限的抗體位點(diǎn)結(jié)合,完成小鼠抗原檢測平臺(tái)的搭建.HRP與過氧化氫（H₂O₂）的催化反應(yīng)使得對苯二酚（H₂Q）被氧化為對苯醌（BQ）,BQ在探針上被還原.利用逼近曲線,通過記錄加入不同濃度比的小鼠抗原混合液時(shí)探針上還原電流的變化來進(jìn)行待測物（小鼠抗原）的檢測,結(jié)果表明,小鼠免疫球蛋白IgG在1～1 000 pg·mL^-1濃度范圍內(nèi),探針電流與濃度的變化呈線性關(guān)系,檢測限為0.1 pg·mL^-1. 

【文章來源】：安徽大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020,44(01)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

基底小鼠抗原檢測平臺(tái)搭建示意圖

選用小鼠免疫球蛋白mouse IgG作為研究對象,利用掃描電化學(xué)顯微鏡的基底產(chǎn)生/探針收集模式對其進(jìn)行檢測.首先利用分子的自組裝等方法將HRP標(biāo)記的小鼠抗原和未標(biāo)記的小鼠抗原固定在基底電極上[14,17-18].在1 mmol·L-1對苯二酚(H2Q)溶液中加入40 μL 5 mmol·L-1過氧化氫溶液,辣根過氧化氫酶(HRP)在過氧化氫(H2O2)存在的條件下將對苯二酚(H2Q)氧化為對苯醌(BQ),根據(jù)逼近曲線的實(shí)驗(yàn)原理[19],將探針電位設(shè)置為對苯醌(BQ)的還原電位,探針不斷向基底電極靠近,可以檢測到BQ在探針上還原產(chǎn)生的電流信號,如圖1所示.由于在自組裝的過程中,加入的羊抗鼠抗體的數(shù)目是少于小鼠抗原和HRP標(biāo)記的小鼠抗原數(shù)目之和的,因此,兩種抗原需要競爭有限的結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)反應(yīng)時(shí)間足夠長時(shí),兩者最終在基底電極上所占據(jù)的位點(diǎn)數(shù)目之比應(yīng)與小鼠抗原混合液中兩者的數(shù)目之比相同.利用這一競爭反應(yīng),在實(shí)驗(yàn)中通過固定HRP標(biāo)記抗原的濃度,不斷減小未標(biāo)記抗原的濃度,使得基底電極中HRP的數(shù)目增加,更多的BQ在探針上被還原.若被檢測物(即小鼠抗原)的濃度越低,相應(yīng)電流信號卻越大;同時(shí)由于不加入H2O2時(shí),沒有BQ生成,探針檢測不到有效的還原電流,即背景電流為零,有效降低了小鼠抗原的檢出限.實(shí)驗(yàn)中主要使用的實(shí)驗(yàn)方法是逼近曲線法,它通過收集探針向基底電極靠近過程中電流的變化對基底電極的性質(zhì)進(jìn)行研究.此外,為了對實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和分析,排除其他因素的干擾,對逼近曲線的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行歸一化處理,橫坐標(biāo)為探針與基底之間的距離d與探針的半徑a的比值,縱坐標(biāo)探針電流IT=iT/iT∞(iT是探針檢測的實(shí)際電流,iT∞是穩(wěn)態(tài)電流),后文中探針電流均為歸一化計(jì)算后的相對電流.

圖3是在5 mmol·L-1 K3[Fe(SCN)6]溶液中,直徑為15 μm的Pt 電極在直徑3 mm Au基底電極修飾過程的逼近曲線示意圖,探針電位為-0.4 V,溶液中Fe3+在探針上被還原為Fe2+.理論上,當(dāng)探針與基底的距離在幾個(gè)探針半徑的范圍內(nèi),探針靠近絕緣界面,由于絕緣體阻礙了Fe3+的擴(kuò)散,探針電流隨著探針與基底距離的減小而減小,但距離接近零時(shí),探針電流也無限趨向于零;而在導(dǎo)體界面,由于電子隧穿效應(yīng)的存在,探針不斷靠近導(dǎo)體界面時(shí)電流會(huì)隨之增大.圖3的曲線a是探針在金界面的逼近曲線,探針不斷向金界面逼近,電流逐漸增大,曲線b～e都表現(xiàn)出與絕緣體類似的性質(zhì),但是與真正的絕緣體仍具有一定的差異,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論和文獻(xiàn)報(bào)道符合[21].其中,曲線b是修飾硫辛酸后金電極的逼近曲線,可以觀察到探針電流隨著探針與基底距離的減小而減小,表明硫辛酸分子在金電極表面形成了有序的分子膜,具有一定的阻礙擴(kuò)散作用,但是基底電極依舊存在部分裸露的金界面,所以探針與基底距離接近零的位置,探針電流約為穩(wěn)態(tài)電流的一半;曲線c是在硫辛酸修飾的基礎(chǔ)上,再修飾羊抗鼠抗體(Ab)的逼近曲線,在距離約為零的位置,探針電流(ITmin=iTmin/iT∞)等于0.32,基底的導(dǎo)電性進(jìn)一步變差,曲線d是用BSA封閉裸露金界面后的逼近曲線,由于基底的導(dǎo)電部分繼續(xù)減少,所以在接近基底電極的位置,ITmin從0.3(曲線c)減小到0.24,曲線e是修飾有小鼠抗原(Ag)的逼近曲線,探針在修飾電極表面的電流減小到0.17,修飾分子數(shù)目增加,基底電極更接近絕緣體的理論值.

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]免疫球蛋白G的免疫納米金催化共振散射光譜分析[D]. 張聲森.廣西師范大學(xué) 2008



本文編號：3279011