發(fā)布時間：2017-04-25 16:19

  本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌毒性噬菌體φPA-HF17的分離鑒定及生物學特性的分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是假單胞菌屬的主要成員，為革蘭染色陰性的非發(fā)酵菌，廣泛分布于自然界的土壤和水中，亦可存在于醫(yī)院潮濕的環(huán)境內(nèi)。銅綠假單胞菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染主要的致病菌之一。特別是當機體免疫功能下降時，，可引起多種疾病，如呼吸機相關(guān)性肺炎、急性下呼吸道炎癥、囊性纖維化患者的慢性呼吸道炎癥、角膜炎、導(dǎo)尿管置留引起的尿道炎以及皮膚和傷口的感染等。由于銅綠假單胞菌適應(yīng)性極強，常成為醫(yī)院內(nèi)爆發(fā)性感染的元兇。此外，銅綠假單胞菌多重耐藥（multidrug-resistant）菌株的不斷出現(xiàn)和生物膜的形成給臨床治療帶來嚴重困難。噬菌體是能夠感染并殺死細菌的病毒，且存在于土壤、海洋、湖泊甚至動物的腸道內(nèi)。鑒于目前耐藥性細菌的嚴峻形勢，噬菌體療法（Phage Therapy）重新引起一些科學工作者們的興趣和有關(guān)國家及一些國際機構(gòu)的重視。 本研究以27株銅綠假單胞菌臨床分離株為宿主菌，采用傳統(tǒng)的雙層瓊脂噬斑法從生活污水和醫(yī)院污水中初步分離出16株毒性噬菌體，從中選擇4株噬菌體（分別命名為φPA-HF7、φPA-HF12、φPA-HF17和φPA-HF20）進行電鏡觀察。結(jié)果顯示，噬菌體φPA-HF7屬于有尾噬菌體目（Caudovirales Order）、長尾病毒科（Siphoviridae）噬菌體,噬菌體φPA-HF12屬于有尾噬菌體目的肌尾病毒科(Myoviridae)噬菌體，φPA-HF17和φPA-HF20則屬于有尾噬菌體目的足尾病毒科（Podoviridae）噬菌體。通過對噬菌體φPA-HF17生物學特性的研究及基因組的初步分析發(fā)現(xiàn)：(1) φPA-HF17的頭部呈立體對稱、直徑約50nm，尾部較短、長約5～10nm；(2) φPA-HF17的基因組為雙鏈DNA，限制性內(nèi)切酶圖譜分析表明，基因組含有Nde I、 Xho I、XbaI、Pst I、Hind III和EcoR I的多個酶切位點，初步推算基因組大小約為38kb；(3) φPA-HF17具有較高的裂解活性，能裂解12株銅綠假單胞菌分離株（裂解率為44.0%）；(4)噬菌體φPA-HF17的最佳感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection, MOI）為0.01；（5）一步生長曲線顯示，φPA-HF17的潛伏期為10分鐘，爆發(fā)期持續(xù)60分鐘，爆發(fā)量為218PFU/cell；（6）吸收試驗表明，當MOI＝0.01時，在4分鐘內(nèi)超過90%的φPA-HF17吸附或穿入宿主細胞內(nèi)；（7）SDS-PAGE蛋白電泳可觀察到3種主要蛋白和至少8種次要蛋白，其中位于40kDa的主要蛋白帶可能是噬菌體φPA-HF17的衣殼蛋白；(8)穩(wěn)定性試驗發(fā)現(xiàn)，噬菌體φPA-HF17在60℃30min和pH4～10的范圍內(nèi)仍具有較高的裂解活性；（9）全基因組測序發(fā)現(xiàn)噬菌體PA-HF17基因組由39208個堿基組成，GC含量達到49.68%，共有46個編碼蛋白質(zhì)的基因，不具備tRNA和rRNA。 根據(jù)上述的研究結(jié)果，得出下列結(jié)論： 1.4株銅綠假單胞菌噬菌體（φPA-HF7、φPA-HF12、φPA-HF17和φPA-HF20）為毒性噬菌體，屬有尾噬菌體目，其中φPA-HF7為長尾病毒科噬菌體，φPA-HF12屬于肌尾病毒科噬菌體，φPA-HF17和φPA-HF20則屬于足尾病毒科噬菌體。 2.φ PA-HF17基因組大小為39208堿基，GC含量百分比為49.6%。 3. φPA-HF17是一種潛伏期短、裂解效率高、裂解譜寬以及在60℃和pH4～10的范圍仍具有裂解活性的噬菌體，可考慮用于耐藥性銅綠假單胞菌感染的噬菌體生物制劑的開發(fā)。
【關(guān)鍵詞】：噬菌體 噬菌體療法 銅綠假單胞菌 細菌耐藥性
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 第一章 文獻綜述13-23
• 1.1 銅綠假單胞菌概述13-14
• 1.2 噬菌體概述14-16
• 1.3 噬菌體療法16-23
• 第二章 銅綠假單胞菌噬菌體的分離鑒定及生物學特性的研究23-51
• 2.1 材料23-24
• 2.1.1 宿主菌株23
• 2.1.2 污水樣本23
• 2.1.3 主要試劑23-24
• 2.1.4 主要儀器24
• 2.2 方法24-34
• 2.2.1 銅綠假單胞菌 16SrRNA 鑒定24-26
• 2.2.2 銅綠假單胞菌噬菌體的分離純化及滴度測定26-27
• 2.2.3 噬菌體透射電子顯微鏡觀察27-28
• 2.2.4 噬菌體 DNA 提取及限制性內(nèi)切酶分析28-29
• 2.2.5 裂解率測定29
• 2.2.6 最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）的測定29-30
• 2.2.7 一步生長曲線的繪制30-31
• 2.2.8 吸收率測定31
• 2.2.9 噬菌體蛋白 SDS-PAGE 分析31-33
• 2.2.10 噬菌體 pH 及溫度穩(wěn)定性測定33-34
• 2.2.11 噬菌體全基因組測序初步分析34
• 2.3 結(jié)果34-47
• 2.3.1 銅綠假單胞菌 16S rRNA 鑒定34-35
• 2.3.2 銅綠假單胞菌噬菌體的分離純化及滴度測定35-37
• 2.3.3 噬菌體透射電子顯微鏡觀察37-39
• 2.3.4 噬菌體核酸提取及限制性內(nèi)切酶分析39-40
• 2.3.5 裂解率測定40-41
• 2.3.6 最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）的測定41-42
• 2.3.7 一步生長曲線的繪制42
• 2.3.8 吸收率測定42-43
• 2.3.9 噬菌體蛋白 SDS-PAGE 分析43-44
• 2.3.10 噬菌體 PH 及溫度穩(wěn)定性測定44-46
• 2.2.11 噬菌體全基因組測序初步分析46-47
• 2.4 討論47-51
• 第三章 結(jié)論51-52
• 參考文獻52-59
• 作者簡介在校期間獲得的科研成果59-61
• 致謝61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 孫偉,朱春寶;噬菌體治療細菌感染的研究[J];國外醫(yī)藥(抗生素分冊);2005年02期

2 施曉群;孫景勇;倪語星;汪復(fù);朱德妹;胡付品;蔣曉飛;徐英春;張小江;胡云建;艾效曼;楊青;孫自鏞;陳中舉;賈蓓;黃文祥;卓超;蘇丹虹;魏蓮花;吳玲;張朝霞;季萍;王傳清;王愛敏;張泓;孔菁;徐元宏;沈繼錄;單斌;杜艷;俞云松;林潔;;2011年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監(jiān)測[J];中國感染與化療雜志;2013年03期

3 羅成,徐斌;噬菌體研究的歷史與現(xiàn)狀[J];生物學雜志;1987年05期

4 王輝,陳民鈞;1994～2001年中國重癥監(jiān)護病房非發(fā)酵糖細菌的耐藥變遷[J];中華醫(yī)學雜志;2003年05期

5 魯會軍,韓文瑜,雷連成;治療性噬菌體制劑研究進展[J];中國獸藥雜志;2002年06期

  本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌毒性噬菌體φPA-HF17的分離鑒定及生物學特性的分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：326628