【目的】MicroRNA（miRNA）是真核細(xì)胞中廣泛存在的長(zhǎng)約22nt的高度保守的單鏈非編碼RNA分子,一般在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)基因的表達(dá)。越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNA可以激活轉(zhuǎn)錄或翻譯。RNA結(jié)合蛋白（RBPs）作為基因表達(dá)的通用調(diào)節(jié)子,影響pre-mRNA的剪切,成熟mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn),定位,代謝和翻譯。RBPs可以通過(guò)直接或間接與miRNA相互作用,協(xié)同或競(jìng)爭(zhēng)性地調(diào)控特定mRNA的表達(dá)。我們前期發(fā)現(xiàn)GRSF1結(jié)合miR-346的特定模序“CCGCAU”,而其側(cè)翼序列與hTERT 3′UTR結(jié)合形成GRSF1-miR-346/hTERT mRNA復(fù)合物并促進(jìn)其募集到核糖體上,從而增加hTERT的表達(dá)。本文旨在探討GRSF1介導(dǎo)miR-346結(jié)合靶基因3′UTR上調(diào)其表達(dá)的詳細(xì)調(diào)控分子機(jī)制�！痉椒ā渴紫�,我們通過(guò)Flag親和純化技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析篩選GRSF1的相互作用蛋白,查閱大量文獻(xiàn)后初步確定可能與GRSF1功能相關(guān)的候選蛋白;通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡分析候選蛋白與GRSF1是否存在相互作用和共定位。接著,我們構(gòu)建了一系列KIF11,RPS2,Ago2,TR... 

【文章來(lái)源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：129 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

miR-346與hTERT3′UTR配對(duì)結(jié)合模式圖

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文子，我們?cè)?HeLa 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照質(zhì)粒及 Flag-GRSF1 質(zhì)粒，采用 Flag親和純化結(jié)合銀染、質(zhì)譜分析篩選可能與 GRSF1 存在相互作用的蛋白。結(jié)果表明，GRSF1 與 225 個(gè)蛋白共純化，包括 ACOT9，TFAM，HSD17B10，RPL14，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道這些蛋白與 GRSF1 存在相互作用。有趣的是，在 GRSF1 蛋白復(fù)合物中還發(fā)現(xiàn)了豐度較高的運(yùn)動(dòng)蛋白 KIF11、23 個(gè)翻譯相關(guān)蛋白和 E3 泛素連接酶 TRIM21（圖 1.1A，B）。通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)分析蛋白功能，我們推測(cè) KIF11，RPS2，RPL29，TRIM21 可能參與 GRSF1 介導(dǎo)的 miR-346 對(duì) hTERT 表達(dá)的上調(diào)，并對(duì)這四個(gè)蛋白進(jìn)行深入研究。

外源性 GRSF1 與 KIF11，RPS2，TRIM21 相Flag-GRSF1 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 48h 后用 Flag-tag 抗 Flag-GRSF1 及內(nèi)源性 KIF11，RPS2，RPL內(nèi)源性 GRSF1 與候選蛋白的相互作用IF11，RPS2，TRIM21 與 GRSF1 在體和 HEK-293T 細(xì)胞中，用 GRSF1 的抗11，RPS2，RPL29，TRIM21 的表達(dá)情RPL29，TRIM21 的抗體進(jìn)行免疫共 1.3 B），結(jié)果表明內(nèi)源性 GRSF1 與內(nèi)，但與內(nèi)源性 RPL29 不存在相互作用


本文編號(hào)：3261498