目的利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模制備以MDCK細(xì)胞為基質(zhì)的H5N1流感全病毒滅活疫苗,并進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)。方法利用7. 5 L生物反應(yīng)器,以5 g/L微載體培養(yǎng)MDCK-G1細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1. 5×10⁶或2. 5×10⁶個(gè)/mL時(shí),以0. 001、0. 000 1、0. 000 01 MOI接種H5N1流感病毒,每12 h取樣檢測(cè)流感病毒血凝滴度,并觀察細(xì)胞形態(tài);利用40 L生物反應(yīng)器進(jìn)行放大培養(yǎng),收獲病毒液后進(jìn)行純化。以不同劑量的細(xì)胞基質(zhì)和雞胚基質(zhì)流感疫苗免疫BALB/c小鼠及攻毒,檢測(cè)免疫原性。結(jié)果當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)1. 5×10⁶個(gè)/mL時(shí),以0. 000 1 MOI接種H5N1流感病毒48 h后,流感病毒滴度可達(dá)1∶1 024。純化后病毒液雜蛋白去除率為91. 2%,回收率為87. 9%,總蛋白與HA比值低于4. 5,符合《中國藥典》三部（2015版）相關(guān)規(guī)定。各劑量組細(xì)胞基質(zhì)疫苗血凝抑制試驗(yàn)中和抗體滴度略高于雞胚基質(zhì)疫苗,其中10μg劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0. 05）,0. 1μg劑量組差異有統(tǒng)計(jì)... 

【文章來源】：中國生物制品學(xué)雜志. 2020,33(01)CSCD

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【部分圖文】：

7.5 L生物反應(yīng)器中接種病毒時(shí)不同細(xì)胞濃度下病毒血凝滴度

結(jié)果顯示，攻毒后PBS組小鼠體重迅速下降，攻毒后第8天全部死亡；其余各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重均先下降后上升，攻毒后14 d，各組存活小鼠體重均恢復(fù)至攻毒前。見圖5。在攻毒后第3天開始出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象，至攻毒后第14天觀察期末，細(xì)胞基質(zhì)疫苗與雞胚基質(zhì)疫苗10μg劑量組均無小鼠死亡，保護(hù)率100%;1和0.1μg劑量組細(xì)胞基質(zhì)疫苗的保護(hù)率分別為80%和40%，均高于雞胚基質(zhì)疫苗（70%和30%），但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.08～1.16,P>0.05）。見圖6。表明細(xì)胞基質(zhì)疫苗對(duì)H5N1攻擊毒株的保護(hù)率非劣效于雞胚基質(zhì)疫苗，MDCK細(xì)胞可作為生產(chǎn)H5N1流感疫苗的基質(zhì)。圖6 攻毒試驗(yàn)小鼠死亡監(jiān)測(cè)

結(jié)果顯示，初免后小鼠中和抗體滴度偏低，加強(qiáng)免疫后明顯升高，第28天達(dá)到峰值。其中10μg劑量組細(xì)胞基質(zhì)疫苗中和抗體滴度達(dá)到最高（1∶414），高于雞胚基質(zhì)疫苗（1∶383），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.45,P>0.05);0.1μg劑量組細(xì)胞基質(zhì)疫苗中和抗體滴度為1∶74，高于雞胚基質(zhì)疫苗（1∶43），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.98,P<0.05）。第35天后，所有劑量組中和抗滴度下降，第49天降至1∶40及以下。見圖4。表明細(xì)胞和雞胚基質(zhì)疫苗均可以產(chǎn)生較好的免疫效果，且細(xì)胞基質(zhì)疫苗免疫原性非劣效于雞胚基質(zhì)疫苗。2.6 攻毒試驗(yàn)


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