本文關(guān)鍵詞：BST-2的糖基化修飾對其抑制細胞內(nèi)部病毒的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人和其他哺乳動物利用宿主限制因子抵御病毒的感染,病毒必須克服這些限制才能有效地在細胞內(nèi)復(fù)制,BST-2/tetherin就是一種重要的受干擾素誘導(dǎo)的宿主限制因子。BST-2通過將新產(chǎn)生的病毒顆粒滯留在細胞表面起到抑制病毒釋放的作用,利用的是GPI端插入病毒衣殼,TM插入宿主的細胞膜上的物理牽拉機制。在BST-2的胞外區(qū)段有兩個保守的天冬氨酸位點能被糖基化修飾,但在抗病毒過程中的作用目前仍不明確。特別是最新研究發(fā)現(xiàn)BST-2不僅能有效抑制細胞表面的病毒,也能有效抑制在細胞內(nèi)部組裝的HBV,而BST-2糖基化修飾在該過程中的作用目前還沒有任何相關(guān)的研究。為了研究糖基化修飾的作用,我們構(gòu)建了BST-2糖基化位點的突變體BST-2N65A,BST-2 N92A,BST-2 N65,92A,并構(gòu)建了相應(yīng)的穩(wěn)定表達細胞系,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細胞表達的BST-2的修飾狀態(tài)更接近于Hela中天然的BST-2,并且是多種糖基化修飾共存。對BST-2穩(wěn)定表達細胞進行細胞組分分離發(fā)現(xiàn)高糖基化和低糖基化的BST-2存在于不同密度的細胞組分中,而糖基化位點突變BST-2更多地以低糖基化形式出現(xiàn)在高密度的組分中。免疫熒光共定位實驗發(fā)現(xiàn)BST-2突變體與ER的共定位效率相當(dāng),而BST-2 N92A和BST-2 N65,92A與CD63的共定位效率跟BST-2 WT相比明顯增加。而這種與CD63定位增強的BST-2 N65,92A能更有效地抑制內(nèi)部組裝的HIV-1和HBV病毒的釋放。最后研究不同BST-2突變體的降解途徑,發(fā)現(xiàn)野生型BST-2和糖基化突變體與EEA1和LAMP1的共定位效率相當(dāng),暗示糖基化修飾只影響了BST-2在CD63中定位,對BST-2的降解途徑并沒有影響。因此我們認為BST-2的糖基化修飾會影響其在亞細胞定位,沒有糖基化修飾的BST-2會更多地存在于CD63陽性囊泡中,所以對多囊泡體中組裝的HIV和HBV具有更強的抑制作用。BST-2的糖基化修飾程度受到某種調(diào)控,通過調(diào)節(jié)自身的糖基化修飾狀態(tài)來平衡其在細胞膜和細胞內(nèi)的分布量,從而保證BST-2既能有效阻滯細胞膜表面釋放的病毒也能有效地抑制在細胞內(nèi)部組裝的病毒的釋放。本文通過研究不同BST-2糖基化突變體的細胞內(nèi)定位和抗病毒作用,發(fā)現(xiàn)糖基化缺失的BST-2更多聚集在CD63陽性囊泡中,揭示了BST-2糖基化修飾對BST-2亞細胞定位的影響,在CD63陽性囊泡中的聚集直接導(dǎo)致BST-2能更有效地抑制細胞內(nèi)部組裝病毒,從機制上說明了糖基化修飾對于BST-2行使功能的重要性,并啟發(fā)我們更深入研究BST-2在CD63陽性囊泡中的功能。
【關(guān)鍵詞】：BST-2 糖基化 CD63 HBV
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R373
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-21
• 1.1 研究背景10-19
• 1.1.1 HIV-1 和艾滋病10-12
• 1.1.2 宿主限制因子和HIV-1 輔助蛋白12-13
• 1.1.3 BST-2 的發(fā)現(xiàn)13
• 1.1.4 BST-2 的信號活性13-14
• 1.1.5 BST-2 抑制細胞膜上組裝的病毒的釋放14-15
• 1.1.6 BST-2 抑制細胞內(nèi)組裝的HBV和HIV-1 的釋放15-16
• 1.1.7 HIV-1 Vpu拮抗BST-2 的機制16-18
• 1.1.8 BST-2 的結(jié)構(gòu)研究進展18-19
• 1.2 研究目標(biāo)19-21
• 第2章 材料和方法21-28
• 2.1 實驗材料、儀器和試劑21-24
• 2.1.1 質(zhì)粒和突變體的構(gòu)建21
• 2.1.2 主要儀器21-22
• 2.1.3 抗體22-23
• 2.1.4 菌株和細胞系23
• 2.1.5 主要試劑23-24
• 2.2 實驗方法24-28
• 2.2.1 點突變24
• 2.2.2 凝膠電泳鑒定24
• 2.2.3 抗性篩選24-25
• 2.2.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染25
• 2.2.5 凝膠電泳和免疫印跡25-26
• 2.2.6 蔗糖墊超速離心法收獲病毒26
• 2.2.7 穩(wěn)定細胞系的建立26
• 2.2.8 細胞組分分離26-27
• 2.2.9 免疫熒光27
• 2.2.10 HBV的產(chǎn)生和檢測27-28
• 第3章 實驗結(jié)果和討論28-39
• 3.1 BST-2 糖基化突變體的修飾狀態(tài)28-29
• 3.2 BST-2 糖基化突變體的亞細胞分布29-30
• 3.3 BST-2 糖基化突變體在CD63陽性囊泡中的分布30-31
• 3.4 BST-2 糖基化突變體有效抑制MVB中組裝的HIV-131-32
• 3.5 BST-2 糖基化突變體有效地抑制HBV病毒的釋放32-35
• 3.6 BST-2 糖基化突變體與EEA1和LAMP1的共定位35-36
• 3.7 討論36-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-49
• 作者簡介及在碩士期間所取得的科研成果49-50
• 致謝50

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