目的:成骨不全（osteogenesis imperfecta）是一種以骨脆性增加、骨結(jié)構(gòu)異常為臨床特征的遺傳性疾病,目前臨床治療以手術(shù)矯正為主,但是多次手術(shù)給患者帶來極大痛苦。在所有成骨不全分類中,Ⅰ型成骨不全發(fā)病率最高,由COL1A1基因單倍劑量不足導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白含量降低引起。Ⅰ型膠原蛋白的改變會影響骨發(fā)育相關(guān)通路,但具體分子機制尚不明確。目前已有的小鼠模型Mov13雖然Ⅰ型膠原蛋白表達降低,但是與臨床病人膠原蛋白水平降低的機制不同,同時該小鼠模型會出現(xiàn)表型減退的現(xiàn)象。因此,本研究擬采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建從致病機制到表型更加接近Ⅰ型成骨不全的小鼠模型,研究Ⅰ型膠原蛋白降低影響小鼠骨形成的機制,并在此基礎(chǔ)上尋找安全有效的治療方法,為臨床成骨不全治療提供新的方法和思路。方法:（1）采用CRISPR/Cas9技術(shù)將小鼠col1a1基因2⁵外顯子敲除,構(gòu)建Ⅰ型成骨不全小鼠模型;采用PCR及瓊脂糖凝膠電泳對小鼠基因型進行鑒定,將Ⅰ型成骨不全小鼠命名為col1a1^+/-365。（2）分別取col1a1^+/-365小... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

小鼠Col1a1基因轉(zhuǎn)錄本分析

L1A1 基因發(fā)生突變導(dǎo)致。NCBI 數(shù)據(jù)庫顯示小鼠 Col1a1 基因包含 51 個外，起始密碼子 ATG 在第 1 個外顯子上，TAA 終止密碼子在第 51 個外顯子 有 四 個 轉(zhuǎn) 錄 本 （ Col1a1-201 ， Col1a1-202 ， Col1a1-203 ， Col1a1-2http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Splice?db=core;g=ENSMUSG000506;r=11:94936224-94953042）（圖 1-1），只有 Col1a1-201 轉(zhuǎn)錄本可以翻譯白質(zhì)，因此以該轉(zhuǎn)錄本作為研究對象。I 型成骨不全小鼠 Col1a1 表達量降該想法與南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院技術(shù)人員交流，經(jīng)過協(xié)商，將 Co因 2~5 外顯子作為 CRISPR/Cas9 作用的位點，如圖 1-2 所示。小鼠模型構(gòu)作由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院完成。圖 1-1 小鼠 Col1a1 基因轉(zhuǎn)錄本分析

圖 1-3 I 型成骨不全小鼠構(gòu)建方案及基因型鑒定A. I 型成骨不全小鼠構(gòu)建方案，藍色十字代表 Cas9 核酸內(nèi)切酶作用位點，綠框代表Col1a1 基因 2~5 外顯子，綠框之間的直線表示內(nèi)含子，F(xiàn) 和 R 表示 PCR 上下游引物位置；B. Col1a1 基因 2~5 外顯子被敲除后氨基酸序列預(yù)測結(jié)果， wt 表示野生型小鼠，col1a1+/-365表示雜合小鼠；C. 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，M 表示 2 kb DNA marker，B 表示無 DNA 模板的空白對照，wt 表示野生型對照。1.2.2 col1a1+/-365小鼠基本特征col1a1+/-365小鼠以及同窩野生型小鼠見圖 1-4A，從圖中可以看出與同窩野生型小鼠相比，col1a1+/-365小鼠身形偏小。對其體重連續(xù)監(jiān)測，結(jié)果如圖 1-4B所示，與同窩相同周齡的野生型小鼠相比，col1a1+/-365小鼠體重更輕。將獲得的col1a1+/-365小鼠互相交配，未得到 Col1a1 基因全部缺失的純合小鼠，文獻報道，Col1a1 基因編碼的 I 型膠原蛋白遍布全身，Col1a1 基因全部敲除的純合子小鼠會出現(xiàn)胚胎致死現(xiàn)象，因此本研究未得到 Col1a1 基因全部缺失的純合小鼠可能由于胚胎致死造成[48]。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Bone Remodeling and Energy Metabolism:New Perspectives[J]. Francisco J.A.de Paula,Clifford J.Rosen.  Bone Research. 2013(01)



本文編號：3228921