目的建立一種基于重組酶介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（RAA）的細(xì)粒棘球絳蟲核酸檢測方法。方法針對細(xì)粒棘球絳蟲12S rRNA基因序列片段,設(shè)計、篩選并合成RAA特異性擴(kuò)增引物和熒光檢測探針,構(gòu)建細(xì)粒棘球絳蟲熒光RAA檢測方法。分別以含靶序列的不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒和不同濃度細(xì)粒棘球絳蟲基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增,評價其檢測靈敏度;分別以細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、十二指腸鉤蟲、華支睪吸蟲、牛帶絳蟲、曼氏迭宮絳蟲、豬帶絳蟲基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增,評價其檢測特異性。結(jié)果成功建立了細(xì)粒棘球絳蟲熒光RAA檢測法,在39℃條件下20 min內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)粒棘球絳蟲基因組DNA特異性擴(kuò)增,最低可以檢測出10拷貝/μL含靶序列的重組質(zhì)粒DN A和0.1 ng/μL細(xì)粒棘球絳蟲基因組DN A樣本,具備較高敏感性;對多房棘球絳蟲、日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、十二指腸鉤蟲、華支睪吸蟲、牛帶絳蟲、曼氏迭宮絳蟲、豬帶絳蟲基因組DNA均無陽性擴(kuò)增,具備較高特異性;且該熒光RAA法可成功檢出細(xì)粒棘球絳蟲包囊中DNA。結(jié)論成功建立了一種快速、靈敏、特異的可用于細(xì)粒棘球絳蟲核酸檢測的熒光R... 

【文章來源】：中國血吸蟲病防治雜志. 2020,32(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

熒光RAA法檢測細(xì)粒棘球絳蟲包囊DNA樣本FigFig.2FluorescentRAAassayfordetectionofDNAsamplesfromEE.granulosuscysts

中國血吸蟲病防治雜志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4間逐漸延長（K值依次為6732、3837、1075、116）。本次實(shí)驗最低可檢測到含有10拷貝/μL重組質(zhì)粒的熒光信號（圖3）。采用熒光RAA法檢測不同濃度細(xì)粒棘球絳蟲基因組DNA樣本。結(jié)果顯示，除陰性對照外，濃度分別為10、1、0.1ng/μL的細(xì)粒棘球絳蟲基因組DNA樣本均出現(xiàn)陽性擴(kuò)增（K值分別為7186、1675、296），檢測敏感性可達(dá)0.1ng/μL基因組DNA（圖4）。圖3以不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒為模板的熒光RAA法檢測敏感性FigFig.3SensitivityoffluorescentRAAassayusingvariouscopynumbersofrecombinantplasmidsastemplates圖4以不同濃度細(xì)粒棘球絳蟲基因組DNA為模板的熒光RAA法檢測敏感性FigFig.4SensitivityoffluorescentRAAassayusingdifferentconcentrationsofEE.granulosusgenomicDNAsamplesastemplates4熒光RAA法檢測特異性分別以細(xì)粒棘球絳蟲包囊、多房棘球絳蟲幼蟲、日本血吸蟲蟲卵、曼氏血吸蟲蟲卵、十二指腸鉤蚴培養(yǎng)物、華支睪吸蟲囊蚴、牛帶絳蟲孕節(jié)、曼氏迭宮絳蟲孕節(jié)、豬帶絳蟲孕節(jié)基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增，結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球絳蟲包囊DNA存在陽性擴(kuò)增（K值為657），其他樣本擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（圖5）。圖5熒光RAA法檢測特異性Figig.5SpecificityoffluorescentRAAassay討論棘球蚴病在我國中西北部地區(qū)仍存在較大范圍流行，嚴(yán)重威脅著流行區(qū)人民群眾身體健康和生活水平［13］；同時，隨著西部牛羊等大量流入東部地區(qū)，也給當(dāng)?shù)貛砹艘欢ǖ募蝌什鞑ワL(fēng)險［1

吸蟲病防治雜志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4間逐漸延長（K值依次為6732、3837、1075、116）。本次實(shí)驗最低可檢測到含有10拷貝/μL重組質(zhì)粒的熒光信號（圖3）。采用熒光RAA法檢測不同濃度細(xì)粒棘球絳蟲基因組DNA樣本。結(jié)果顯示，除陰性對照外，濃度分別為10、1、0.1ng/μL的細(xì)粒棘球絳蟲基因組DNA樣本均出現(xiàn)陽性擴(kuò)增（K值分別為7186、1675、296），檢測敏感性可達(dá)0.1ng/μL基因組DNA（圖4）。圖3以不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒為模板的熒光RAA法檢測敏感性FigFig.3SensitivityoffluorescentRAAassayusingvariouscopynumbersofrecombinantplasmidsastemplates圖4以不同濃度細(xì)粒棘球絳蟲基因組DNA為模板的熒光RAA法檢測敏感性FigFig.4SensitivityoffluorescentRAAassayusingdifferentconcentrationsofEE.granulosusgenomicDNAsamplesastemplates4熒光RAA法檢測特異性分別以細(xì)粒棘球絳蟲包囊、多房棘球絳蟲幼蟲、日本血吸蟲蟲卵、曼氏血吸蟲蟲卵、十二指腸鉤蚴培養(yǎng)物、華支睪吸蟲囊蚴、牛帶絳蟲孕節(jié)、曼氏迭宮絳蟲孕節(jié)、豬帶絳蟲孕節(jié)基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增，結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球絳蟲包囊DNA存在陽性擴(kuò)增（K值為657），其他樣本擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（圖5）。圖5熒光RAA法檢測特異性Figig.5SpecificityoffluorescentRAAassay討論棘球蚴病在我國中西北部地區(qū)仍存在較大范圍流行，嚴(yán)重威脅著流行區(qū)人民群眾身體健康和生活水平［13］；同時，隨著西部牛羊等大量流入東部地區(qū)，也給當(dāng)?shù)貛砹艘欢ǖ募蝌什鞑ワL(fēng)險［14］

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2011-2018年宜興市棘球蚴病監(jiān)測[J]. 梁靜,薛志強(qiáng),李學(xué)兵,孫旭峰.  中國血吸蟲病防治雜志. 2019(06)
[2]重組酶介導(dǎo)的華支睪吸蟲特異性核酸等溫擴(kuò)增方法的建立及初步評價[J]. 張強(qiáng),丁昕,吳小珉,劉燕紅,劉劍峰,徐祥珍,應(yīng)清界,曹俊,戴洋.  中國血吸蟲病防治雜志. 2019(05)
[3]重組酶介導(dǎo)的隱孢子蟲屬特異性等溫核酸擴(kuò)增方法的建立及評價[J]. 倪碧嫻,吳小珉,劉燕紅,徐祥珍,應(yīng)清界,曹俊,戴洋.  中國血吸蟲病防治雜志. 2019(04)
[4]重組酶介導(dǎo)的核酸等溫擴(kuò)增熒光法快速檢測日本血吸蟲感染性釘螺[J]. 李婷,劉燕紅,趙松,熊春蓉,董萱,張鍵鋒,李偉,應(yīng)清界,楊坤.  中國血吸蟲病防治雜志. 2019(02)
[5]等溫擴(kuò)增技術(shù)在寄生蟲及其他病原體檢測中的應(yīng)用[J]. 李婷,楊坤.  中國血吸蟲病防治雜志. 2018(02)
[6]牛羊包蟲病實(shí)驗室診斷技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 孫雨,王曉英,董浩,曲萍,胡冬梅,趙柏林,石慧,宋曉暉.  中國草食動物科學(xué). 2016(01)
[7]我國主要動物源性寄生蟲病檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 蓋文燕,王君瑋,王娟,曲志娜,黃秀梅,李玉清,洪軍.  中國動物檢疫. 2013(12)
[8]包蟲病診斷技術(shù)與預(yù)防疫苗的研究進(jìn)展[J]. 趙莉,張旭,張壯志,馬正海,古努爾·吐爾遜,張文寶,石保新.  疾病預(yù)防控制通報. 2013(02)
[9]環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測細(xì)粒棘球絳蟲DNA的初步研究[J]. 徐祥珍,金小林,李健,江文才,蔣崗.  中國血吸蟲病防治雜志. 2011(05)



本文編號：3224784