目的建立一種可用于曼氏血吸蟲特異性基因片段檢測的重組酶介導的核酸等溫擴增方法（Recombinase-aided amplification,RAA）。方法以曼氏血吸蟲121 bp高重復基因片段作為靶序列,根據(jù)RAA反應原理設計、合成引物及熒光探針,建立并優(yōu)化熒光RAA法反應體系。分別以不同拷貝數(shù)的含121 bp基因片段的重組質(zhì)粒及不同濃度曼氏血吸蟲基因組DNA為模板進行熒光RAA法擴增,評價該方法的敏感性;分別以日本和埃及血吸蟲蟲卵、十二指腸鉤蟲蟲卵、華支睪吸蟲囊蚴基因組DNA為模板進行熒光RAA法檢測,評價其特異性。結果建立的熒光RAA法可在39℃、20 min內(nèi)特異性擴增曼氏血吸蟲基因組DNA。以重組質(zhì)粒為模板,熒光RAA法最低可檢出的質(zhì)�？截悢�(shù)為10拷貝/μL;以基因組DNA為模板,熒光RAA法最低可檢測濃度為0.1 fg/μL。以日本血吸蟲蟲卵、埃及血吸蟲蟲卵、十二指腸鉤蟲蟲卵、華支睪吸蟲囊蚴基因組DNA為模板進行熒光RAA法檢測,結果均為陰性。結論成功建立了一種可用于曼氏血吸蟲DN A檢測的熒光RAA法,該方法反應快捷、操作簡便,敏感性和特異性均較好。 

【文章來源】：中國血吸蟲病防治雜志. 2020,32(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

以不同基因組DNA為模板的熒光RAA法特異性FigFig.5SpecificityoffluorescentRAAassayusingthegenomicDNNAfromvariousparasitesastemplatesA

rol;2ProductsofRAAamplificationofS.mansonigenomicDNAastemplate;MDNAmolecularmarker圖1以曼氏血吸蟲基因組DNA為模板的RAA擴增產(chǎn)物11.5%瓊脂糖電泳Figig.111.5%agaroseelectrophoresisofproductsofRAAamplificationofSS.mansonigenomicDNAasatemplate2以曼氏血吸蟲基因組DNA為模板的熒光RAA反應以曼氏血吸蟲成蟲基因組DNA樣本為模板進行熒光RAA擴增，在反應溫度為39℃時，熒光信號在5min內(nèi)即出現(xiàn)明顯而快速上升，結果為陽性，陰性對照反應熒光信號則無明顯上升（圖2）。圖2以曼氏血吸蟲基因組DNA為模板的熒光RAA擴增FigFig.2FluorescentRAAamplificationofSS.mansonigenomicDNAusedasatemplate3熒光RAA法檢測敏感性3.1以含曼氏血吸蟲121bp重復序列的重組質(zhì)粒為模板的敏感性以不同拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒為模板進行熒光RAA擴增，20min內(nèi)所有樣品均出現(xiàn)明顯擴增。隨著重組質(zhì)�？截悢�(shù)降低，檢測到明顯增加的熒··337

中國血吸蟲病防治雜志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4光信號所需時間逐漸延長，最低可檢測到含有10拷貝/μL重組質(zhì)粒的熒光信號。陰性對照反應熒光信號無明顯增加（圖3）。3.2以不同濃度曼氏血吸蟲基因組DNA為模板的熒光RAA法敏感性以曼氏血吸蟲基因組DNA為模板進行熒光RAA擴增，0.1~1pg/μL不同濃度樣本均有擴增且在20min前均可檢測到，最低檢出濃度可達到0.1fg/μL。陰性對照反應熒光信號無明顯增加（圖4）。圖3以重組質(zhì)粒為模板的熒光RAA法檢測敏感性FigFig.3SensitivityoffluorescentRAAassaybyusingrecombinantplasmidsastemplates圖4以不同不同濃度曼氏血吸蟲DNA為模板的熒光RAA法敏感性FigFig.4SensitivityoffluorescentRAAassayusingSS.mansonigenomicDNAatdifferentconcentrationsastemplates4熒光RAA法檢測特異性分別以曼氏血吸蟲成蟲DNA以及日本血吸蟲蟲卵、埃及血吸蟲蟲卵、華支睪吸蟲囊蚴和十二指腸鉤蟲蟲卵DNA為模板進行熒光RAA擴增，僅以曼氏血吸蟲成蟲DNA為模板的RAA反應在10min內(nèi)檢測到明顯增加的熒光信號，結果為陽性。其他樣本反應的熒光信號均未檢測到明顯增加，結果為陰性（圖5）。圖5以不同基因組DNA為模板的熒光RAA法特異性FigFig.5SpecificityoffluorescentRAAassayusingthegenomicDNNAfromvariousparasitesastemplatesA討論我國是日本血吸蟲病流行區(qū)，經(jīng)過多年積極防控，血吸蟲病防治工作取得了舉世矚目的巨大成就，血吸蟲病疫情已處于歷史較低水平［17］，但對境外輸入性曼氏、埃及、間插血吸蟲病和湄公血吸蟲病研究甚少

【參考文獻】：
期刊論文
[1]2018年全國血吸蟲病疫情通報[J]. 張利娟,徐志敏,郭婧怡,戴思敏,黨輝,呂山,許靜,李石柱,周曉農(nóng).  中國血吸蟲病防治雜志. 2019(06)
[2]輸入性曼氏血吸蟲病監(jiān)測與防控對策專家共識[J]. 周曉農(nóng),李石柱,許靜,陳家旭,聞禮永,張仁利,呂超.  中國血吸蟲病防治雜志. 2019(06)
[3]重組酶介導的隱孢子蟲屬特異性等溫核酸擴增方法的建立及評價[J]. 倪碧嫻,吳小珉,劉燕紅,徐祥珍,應清界,曹俊,戴洋.  中國血吸蟲病防治雜志. 2019(04)
[4]重組酶介導的核酸等溫擴增熒光法快速檢測日本血吸蟲感染性釘螺[J]. 李婷,劉燕紅,趙松,熊春蓉,董萱,張鍵鋒,李偉,應清界,楊坤.  中國血吸蟲病防治雜志. 2019(02)
[5]境外血吸蟲病輸入我國的現(xiàn)狀及面臨風險[J]. 張劍鋒,聞禮永,許靜,梁幼生,嚴曉嵐,任光輝,賈鐵武,汪偉,周曉農(nóng).  中國血吸蟲病防治雜志. 2019(01)
[6]重組酶介導的日本血吸蟲特異性基因片段核酸等溫擴增檢測方法的建立[J]. 趙松,李婷,楊坤,李偉,張鍵鋒,郭利川,劉燕紅,戴洋,應清界,羊海濤.  中國血吸蟲病防治雜志. 2018(03)
[7]北京市6例輸入性曼氏血吸蟲病臨床特點分析[J]. 鄒洋,王磊,李小麗,田小軍,李威,安亦君,齊志群,李晶晶,王非,黃敏君.  中國血吸蟲病防治雜志. 2017(02)
[8]深圳市大沙河、觀瀾河藁桿雙臍螺分布及其生態(tài)環(huán)境調(diào)查[J]. 高世同,李曉恒,黃少玉,謝旭,梅樹江,阮彩文,黃達娜.  中國熱帶醫(yī)學. 2013(03)
[9]184例疑似輸入性埃及血吸蟲病病例回顧性調(diào)查[J]. 易平,袁里平,王璋華,何永康,荊群山,周杰,王洪波,李勝明,Franziska Bieri.  中國血吸蟲病防治雜志. 2011(04)
[10]輸入性曼氏血吸蟲病臨床分析[J]. 鄒洋,齊志群,馮曼玲,王非,李威,栗紹剛,許熾熛,谷俊朝.  中國熱帶醫(yī)學. 2011(02)



本文編號：3222917