目的建立一種可用于曼氏血吸蟲特異性基因片段檢測(cè)的重組酶介導(dǎo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法（Recombinase-aided amplification,RAA）。方法以曼氏血吸蟲121 bp高重復(fù)基因片段作為靶序列,根據(jù)RAA反應(yīng)原理設(shè)計(jì)、合成引物及熒光探針,建立并優(yōu)化熒光RAA法反應(yīng)體系。分別以不同拷貝數(shù)的含121 bp基因片段的重組質(zhì)粒及不同濃度曼氏血吸蟲基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA法擴(kuò)增,評(píng)價(jià)該方法的敏感性;分別以日本和埃及血吸蟲蟲卵、十二指腸鉤蟲蟲卵、華支睪吸蟲囊蚴基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA法檢測(cè),評(píng)價(jià)其特異性。結(jié)果建立的熒光RAA法可在39℃、20 min內(nèi)特異性擴(kuò)增曼氏血吸蟲基因組DNA。以重組質(zhì)粒為模板,熒光RAA法最低可檢出的質(zhì)�？截悢�(shù)為10拷貝/μL;以基因組DNA為模板,熒光RAA法最低可檢測(cè)濃度為0.1 fg/μL。以日本血吸蟲蟲卵、埃及血吸蟲蟲卵、十二指腸鉤蟲蟲卵、華支睪吸蟲囊蚴基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA法檢測(cè),結(jié)果均為陰性。結(jié)論成功建立了一種可用于曼氏血吸蟲DN A檢測(cè)的熒光RAA法,該方法反應(yīng)快捷、操作簡(jiǎn)便,敏感性和特異性均較好。 

【文章來源】：中國(guó)血吸蟲病防治雜志. 2020,32(04)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

以不同基因組DNA為模板的熒光RAA法特異性FigFig.5SpecificityoffluorescentRAAassayusingthegenomicDNNAfromvariousparasitesastemplatesA

rol;2ProductsofRAAamplificationofS.mansonigenomicDNAastemplate;MDNAmolecularmarker圖1以曼氏血吸蟲基因組DNA為模板的RAA擴(kuò)增產(chǎn)物11.5%瓊脂糖電泳Figig.111.5%agaroseelectrophoresisofproductsofRAAamplificationofSS.mansonigenomicDNAasatemplate2以曼氏血吸蟲基因組DNA為模板的熒光RAA反應(yīng)以曼氏血吸蟲成蟲基因組DNA樣本為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增，在反應(yīng)溫度為39℃時(shí)，熒光信號(hào)在5min內(nèi)即出現(xiàn)明顯而快速上升，結(jié)果為陽(yáng)性，陰性對(duì)照反應(yīng)熒光信號(hào)則無明顯上升（圖2）。圖2以曼氏血吸蟲基因組DNA為模板的熒光RAA擴(kuò)增FigFig.2FluorescentRAAamplificationofSS.mansonigenomicDNAusedasatemplate3熒光RAA法檢測(cè)敏感性3.1以含曼氏血吸蟲121bp重復(fù)序列的重組質(zhì)粒為模板的敏感性以不同拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增，20min內(nèi)所有樣品均出現(xiàn)明顯擴(kuò)增。隨著重組質(zhì)�？截悢�(shù)降低，檢測(cè)到明顯增加的熒··337

中國(guó)血吸蟲病防治雜志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4光信號(hào)所需時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，最低可檢測(cè)到含有10拷貝/μL重組質(zhì)粒的熒光信號(hào)。陰性對(duì)照反應(yīng)熒光信號(hào)無明顯增加（圖3）。3.2以不同濃度曼氏血吸蟲基因組DNA為模板的熒光RAA法敏感性以曼氏血吸蟲基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增，0.1~1pg/μL不同濃度樣本均有擴(kuò)增且在20min前均可檢測(cè)到，最低檢出濃度可達(dá)到0.1fg/μL。陰性對(duì)照反應(yīng)熒光信號(hào)無明顯增加（圖4）。圖3以重組質(zhì)粒為模板的熒光RAA法檢測(cè)敏感性FigFig.3SensitivityoffluorescentRAAassaybyusingrecombinantplasmidsastemplates圖4以不同不同濃度曼氏血吸蟲DNA為模板的熒光RAA法敏感性FigFig.4SensitivityoffluorescentRAAassayusingSS.mansonigenomicDNAatdifferentconcentrationsastemplates4熒光RAA法檢測(cè)特異性分別以曼氏血吸蟲成蟲DNA以及日本血吸蟲蟲卵、埃及血吸蟲蟲卵、華支睪吸蟲囊蚴和十二指腸鉤蟲蟲卵DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增，僅以曼氏血吸蟲成蟲DNA為模板的RAA反應(yīng)在10min內(nèi)檢測(cè)到明顯增加的熒光信號(hào)，結(jié)果為陽(yáng)性。其他樣本反應(yīng)的熒光信號(hào)均未檢測(cè)到明顯增加，結(jié)果為陰性（圖5）。圖5以不同基因組DNA為模板的熒光RAA法特異性FigFig.5SpecificityoffluorescentRAAassayusingthegenomicDNNAfromvariousparasitesastemplatesA討論我國(guó)是日本血吸蟲病流行區(qū)，經(jīng)過多年積極防控，血吸蟲病防治工作取得了舉世矚目的巨大成就，血吸蟲病疫情已處于歷史較低水平［17］，但對(duì)境外輸入性曼氏、埃及、間插血吸蟲病和湄公血吸蟲病研究甚少

【參考文獻(xiàn)】：
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