本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)的miR-505在下丘腦過表達(dá)對(duì)小鼠性發(fā)育的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：miRNAs（MicroRNAs）是一類具有調(diào)控功能的、內(nèi)源性的天然非編碼小RNA，其大小約為20—25個(gè)核苷酸；隨著研究技術(shù)手段的提高和研究?jī)?nèi)容的深入，越來越多的研究結(jié)果表明：miRNAs可以調(diào)控大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，以及參與大量生物過程的調(diào)節(jié)。許多人類疾病的發(fā)生，往往伴隨著各種miRNAs非正常水平的表達(dá)。目前，miRNAs被普遍認(rèn)為是具有生物學(xué)意義的潛在生物靶標(biāo)、疾病調(diào)節(jié)器，并可以成為疾病治療藥物的靶點(diǎn)。 我們的前期遺傳學(xué)研究結(jié)果提示，位于小鼠X染色體：57647578-57647667處的miR-505，可能參與了小鼠性發(fā)育啟動(dòng)的調(diào)控，但對(duì)其生物學(xué)功能的研究才剛剛起步。迄今為止的研究表明，miR-505可以通過誘導(dǎo)凋亡抑制細(xì)胞的增殖，其唯一被驗(yàn)證的靶蛋白ASF/SF2參與了mTOR信號(hào)通路的調(diào)控。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-505與性發(fā)育的關(guān)系及解析其可能的機(jī)制，本課題使用慢病毒定點(diǎn)注射的方法構(gòu)建在下丘腦中過表達(dá)miR-505的小鼠模型，并通過該模型研究miR-505過表達(dá)對(duì)雌鼠性發(fā)育各種表型的影響，探討miR-505與性發(fā)育啟動(dòng)的關(guān)系。 方法：利用本室構(gòu)建的過表達(dá)miR-505慢病毒載體，包裝得到表達(dá)miR 505的慢病毒顆粒，將出生15天的C57/BL6J雌性小鼠在腦立體定位儀進(jìn)行下丘腦定位，將（1μl）的慢病毒注射到下丘腦中，構(gòu)建miR-505在下丘腦中過表達(dá)小鼠模型，注射后每隔5天取腦制作冰凍切片，采用原位雜交和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，進(jìn)行miR-505檢測(cè)和示蹤，以確認(rèn)模型的構(gòu)建成功。利用該模型觀察和記錄小鼠的性發(fā)育表型：包括體重增長(zhǎng)、陰門開啟時(shí)間、子鼠出生數(shù)量、流產(chǎn)率等；處死小鼠后，收集血清，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定小鼠血清中LH（促黃體生成素）、GnRH（促性腺激素釋放激素）濃度；制作卵巢切片，觀察并統(tǒng)計(jì)卵巢中卵泡的組織學(xué)形態(tài)與各級(jí)卵泡的數(shù)量；制作腦冰凍切片，用原位雜交ISH（in situ hybridization）方法對(duì)不同表型的小鼠下丘腦中miR 505的表達(dá)部位及數(shù)量進(jìn)行示蹤； 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在注射部位的小鼠下丘腦區(qū)域，miR-505表達(dá)量較對(duì)照組有明顯提高，表明用該方法成功構(gòu)建了miR-505在下丘腦中過表達(dá)的小鼠模型；與對(duì)照小鼠相比，模型小鼠體重增長(zhǎng)緩慢，并且每日平均體重輕2-3g；陰門開啟時(shí)間36.67±0.7993天，較對(duì)照組推遲3天；從合籠后到子鼠出生時(shí)間25.83±1.144天，較對(duì)照組延長(zhǎng)3天；且流產(chǎn)率提高12%，并有8%的不育；模型小鼠生育后，子代數(shù)量減少、死亡率提高；卵巢切片的結(jié)果顯示，模型小鼠卵巢中黃體出現(xiàn)時(shí)間推遲、數(shù)量也少于對(duì)照組；模型小鼠血清中LH（促黃體生成激素）含量低于對(duì)照組，GnRH（促性腺激素釋放激素）含量出現(xiàn)不規(guī)律波動(dòng)；腦切片中原位雜交的結(jié)果顯示miR-505過表達(dá)部位對(duì)表型有影響。 結(jié)論：利用慢病毒注射未成年小鼠下丘腦腦區(qū)的方法，成功構(gòu)建了下丘腦中過表達(dá)miR-505的模型；使用鎖核酸標(biāo)記探針與酪酰胺信號(hào)放大系統(tǒng)的原位雜交方法檢測(cè)miRNA表達(dá)規(guī)律較穩(wěn)定，且重復(fù)率高；模型小鼠與對(duì)照小鼠在生長(zhǎng)發(fā)育、性發(fā)育啟動(dòng)時(shí)間、血清中促性腺激素含量及生殖能力等一系列生殖發(fā)育表型中表現(xiàn)出明顯的差異，說明miR-505參與調(diào)控了小鼠的性發(fā)育和生殖過程，為對(duì)其生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：MicroRNA 性發(fā)育 過表達(dá)動(dòng)物模型 鎖核酸 酪酰胺信號(hào)放大系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R339.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 目錄9-11
• 第一章 前言11-19
• 1.1 哺乳動(dòng)物性發(fā)育研究進(jìn)展11-14
• 1.1.1 性發(fā)育過程中的神經(jīng)內(nèi)分泌11-12
• 1.1.2 性發(fā)育過程中的相關(guān)基因12-13
• 1.1.3 小鼠性發(fā)育過程中的性狀13-14
• 1.2 立題背景14-16
• 1.2.1 本實(shí)驗(yàn)室 QTL 定位進(jìn)展14
• 1.2.2 miR  505 研究進(jìn)展14-15
• 1.2.3 miRNA 過表達(dá)載體15
• 1.2.4 原位雜交15-16
• 1.3 實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容16-18
• 1.4 實(shí)驗(yàn)研究意義18-19
• 第二章 材料與方法19-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-22
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)群體19
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑19-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-36
• 2.2.1 小鼠飼養(yǎng)22-23
• 2.2.2 原位注射23-24
• 2.2.3 制作冰凍切片24-26
• 2.2.4 總 RNA 抽提及定量26-27
• 2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR27-30
• 2.2.6 卵巢 HE 染色觀察30
• 2.2.7 生殖表型觀察30-31
• 2.2.8 ELISA 檢測(cè)激素含量31-34
• 2.2.9 原位雜交34-36
• 2.3 數(shù)據(jù)分析36-38
• 2.3.1 基于 RT-PCR 的基因相對(duì)表達(dá)量分析36-37
• 2.3.2 ELISA 數(shù)據(jù)處理37
• 2.3.3 性發(fā)育表型數(shù)據(jù)處理37-38
• 第三章 結(jié)果與分析38-55
• 3.1 動(dòng)物模型構(gòu)建的驗(yàn)證38-40
• 3.1.1 RT-PCR 檢測(cè) miR-505 含量變化38-39
• 3.1.2 原位雜交方法示蹤 miR-50539-40
• 3.2 性發(fā)育表型的觀測(cè)40-45
• 3.2.1 各組小鼠注射后體重增長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)40-41
• 3.2.2 各組小鼠注射后陰門開啟時(shí)間的監(jiān)測(cè)41-42
• 3.2.3 各組小鼠合籠到子鼠出生時(shí)間的監(jiān)測(cè)42-43
• 3.2.4 各組小鼠子鼠出生及死亡的監(jiān)測(cè)43-44
• 3.2.5 各組小鼠懷孕情況的監(jiān)測(cè)44-45
• 3.3 卵巢發(fā)育相關(guān)表型檢測(cè)45-49
• 3.3.1 各級(jí)卵泡的組織學(xué)形態(tài)觀察45-46
• 3.3.2 各組小鼠卵巢組織學(xué)形態(tài)觀察46-49
• 3.4 各組小鼠模型中相關(guān)雌激素水平的檢測(cè)49-52
• 3.4.1 各組小鼠促黃體生成激素含量測(cè)定49-50
• 3.4.2 各組小鼠促性腺激素釋放激素含量測(cè)定50-52
• 3.5 不同注射位置對(duì)小鼠表型的影響52-55
• 3.5.1 子鼠減少小鼠的原位雜交52-53
• 3.5.2 不育小鼠的原位雜交53-55
• 第四章 討論55-59
• 4.1 慢病毒載體的定點(diǎn)注射55-56
• 4.2 目的基因相對(duì)表達(dá)水平測(cè)定56
• 4.3 原位雜交技術(shù)56-59
• 第五章 結(jié)論與展望59-61
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 課題來源66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文目錄67-68
• 致謝68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 羅小平,王慕逖;性早熟診斷與治療的現(xiàn)狀和進(jìn)展[J];臨床兒科雜志;2002年09期

2 徐勇,楊魯靜;青春期性發(fā)育調(diào)控的研究進(jìn)展[J];中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2004年01期

  本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)的miR-505在下丘腦過表達(dá)對(duì)小鼠性發(fā)育的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：319639