CXC趨化因子受體2（the CXC chemokine receptor 2,CXCR2）介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化在細(xì)菌感染、慢性炎癥、腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,但是目前對(duì)于CXCR2受體及下游信號(hào)的調(diào)控并未被完全揭示。該研究首先以Flag-CXCR2-Tango質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)Flag-CXCR2的特異性引物,PCR擴(kuò)增后將其連接至pCDH-MCS-T2A-Neo-MSCV慢病毒表達(dá)載體上,隨后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序及表達(dá)驗(yàn)證。接著在HEK-293T細(xì)胞中包裝過(guò)表達(dá)Flag-CXCR2的慢病毒顆粒并感染HEK-293細(xì)胞,使用遺傳霉素篩選后,蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Flag-CXCR2穩(wěn)定表達(dá)在HEK-293細(xì)胞膜上。最后利用白細(xì)胞介素-8（interleukin-8,IL-8）刺激過(guò)表達(dá)Flag-CXCR2的細(xì)胞株,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CXCR2下游信號(hào)通路活化及F-actin組裝。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào). 2020,42(08)CSCD

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穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Flag-CXCR2的HEK-293細(xì)胞株的活性鑒定

CXCR2作為膜受體,在靜息狀態(tài)下定位于細(xì)胞膜。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照和表達(dá)Flag-CXCR2的細(xì)胞株進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達(dá)Flag-CXCR2受體的細(xì)胞株在細(xì)胞膜上能夠明顯看到綠光,而對(duì)照組則無(wú)綠光,這表明Flag-CXCR2蛋白成功定位細(xì)胞膜(圖3B)。2.4 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Flag-CXCR2的HEK-293細(xì)胞株的活性鑒定

CXCR2受體與配體結(jié)合后,一方面能夠?qū)е翽I3K-AKT以及MAPK信號(hào)通路的活化,另一方面能夠促使F-actin發(fā)生極化,為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)做準(zhǔn)備。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Flag-CXCR2的細(xì)胞株進(jìn)行IL-8刺激。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)Flag-CXCR2受體的細(xì)胞株中p-JNK、p-P38、p-AKT在IL-8刺激短時(shí)間內(nèi)活化明顯增強(qiáng);但在刺激后15 min時(shí),活化現(xiàn)象消失(圖4A)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在IL-8刺激30 s時(shí),過(guò)表達(dá)Flag-CXCR2受體細(xì)胞株F-actin瞬間發(fā)生極化且明顯高于對(duì)照組,隨著時(shí)間的增加,其F-actin極化逐漸減少,直到恢復(fù)到靜息狀態(tài)(圖4B)。CXCR2是重要的趨化受體,能夠響應(yīng)IL-8的刺激,促使細(xì)胞發(fā)生趨化。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照和表達(dá)Flag-CXCR2的細(xì)胞株進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達(dá)Flag-CXCR2受體的細(xì)胞株趨化能力增強(qiáng),發(fā)生趨化的細(xì)胞明顯多于對(duì)照組,這表明Flag-CXCR2蛋白成功介導(dǎo)細(xì)胞趨化(圖4C)。以上結(jié)果表明,穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Flag-CXCR2的HEK-293細(xì)胞株能夠良好響應(yīng)配體刺激。圖3 HEK-293細(xì)胞株中Flag-CXCR2的表達(dá)與定位

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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