CXC趨化因子受體2（the CXC chemokine receptor 2,CXCR2）介導的中性粒細胞趨化在細菌感染、慢性炎癥、腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關重要的作用,但是目前對于CXCR2受體及下游信號的調控并未被完全揭示。該研究首先以Flag-CXCR2-Tango質粒為模板設計Flag-CXCR2的特異性引物,PCR擴增后將其連接至pCDH-MCS-T2A-Neo-MSCV慢病毒表達載體上,隨后對陽性克隆進行測序及表達驗證。接著在HEK-293T細胞中包裝過表達Flag-CXCR2的慢病毒顆粒并感染HEK-293細胞,使用遺傳霉素篩選后,蛋白質免疫印跡和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),Flag-CXCR2穩(wěn)定表達在HEK-293細胞膜上。最后利用白細胞介素-8（interleukin-8,IL-8）刺激過表達Flag-CXCR2的細胞株,檢測發(fā)現(xiàn)CXCR2下游信號通路活化及F-actin組裝。 

【文章來源】：中國細胞生物學學報. 2020,42(08)CSCD

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穩(wěn)定過表達Flag-CXCR2的HEK-293細胞株的活性鑒定

CXCR2作為膜受體,在靜息狀態(tài)下定位于細胞膜。本實驗將對照和表達Flag-CXCR2的細胞株進行免疫熒光檢測。結果顯示,穩(wěn)定表達Flag-CXCR2受體的細胞株在細胞膜上能夠明顯看到綠光,而對照組則無綠光,這表明Flag-CXCR2蛋白成功定位細胞膜(圖3B)。2.4 穩(wěn)定過表達Flag-CXCR2的HEK-293細胞株的活性鑒定

CXCR2受體與配體結合后,一方面能夠導致PI3K-AKT以及MAPK信號通路的活化,另一方面能夠促使F-actin發(fā)生極化,為細胞運動做準備。本實驗將對照和穩(wěn)定過表達Flag-CXCR2的細胞株進行IL-8刺激。蛋白質免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),過表達Flag-CXCR2受體的細胞株中p-JNK、p-P38、p-AKT在IL-8刺激短時間內活化明顯增強;但在刺激后15 min時,活化現(xiàn)象消失(圖4A)。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),在IL-8刺激30 s時,過表達Flag-CXCR2受體細胞株F-actin瞬間發(fā)生極化且明顯高于對照組,隨著時間的增加,其F-actin極化逐漸減少,直到恢復到靜息狀態(tài)(圖4B)。CXCR2是重要的趨化受體,能夠響應IL-8的刺激,促使細胞發(fā)生趨化。本實驗將對照和表達Flag-CXCR2的細胞株進行Transwell實驗。結果顯示,穩(wěn)定表達Flag-CXCR2受體的細胞株趨化能力增強,發(fā)生趨化的細胞明顯多于對照組,這表明Flag-CXCR2蛋白成功介導細胞趨化(圖4C)。以上結果表明,穩(wěn)定過表達Flag-CXCR2的HEK-293細胞株能夠良好響應配體刺激。圖3 HEK-293細胞株中Flag-CXCR2的表達與定位

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3143018