本文關(guān)鍵詞：變異鏈球菌ClpCP蛋白酶作用機(jī)制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:Clp蛋白酶廣泛存在于各種生物體,尤其是低GC含量的革蘭陽(yáng)性菌中。研究發(fā)現(xiàn)在外界應(yīng)激條件下,Clp蛋白酶可以通過重新折疊或降解的方式,對(duì)錯(cuò)誤折疊并累積的蛋白質(zhì)進(jìn)行修正或者清除。研究發(fā)現(xiàn),Clp蛋白酶由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成,其中催化亞基為含有絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)的Clp P蛋白,調(diào)節(jié)亞基為存在于細(xì)菌中高度保守的Clp ATP酶。Clp C作為Clp ATP酶的重要成員之一,可與Clp P蛋白發(fā)生特異性結(jié)合形成Clp CP,參與由Mcs AB介導(dǎo)的熱休克蛋白Cts R的降解。在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)中,Clp CP蛋白酶可借由Mec A蛋白的介導(dǎo)參與其感受態(tài)形成系統(tǒng)Com K/S的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控B.subtilis感受態(tài)細(xì)胞的形成。研究證實(shí),變異鏈球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)與B.subtilis同為低GC含量的革蘭陽(yáng)性菌,且Clp蛋白水解系統(tǒng)具有較高的同源性。同源性比對(duì)證實(shí),變異鏈球菌中存在著Clp P和五種Clp ATP酶,包括:Clp B、Clp C、Clp E、Clp L和Clp X。因此,本研究擬構(gòu)建變異鏈球菌S.mutans的clp P/clp C基因缺陷株,并通過細(xì)菌形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、平板生存試驗(yàn)、適應(yīng)性耐藥、生物膜形成試驗(yàn)、感受態(tài)基因表達(dá)測(cè)定、感受肽細(xì)胞轉(zhuǎn)化率等初步探討Clp蛋白酶在變異鏈球菌應(yīng)激耐受中的作用及其相關(guān)機(jī)制。方法:(1)本研究以變異鏈球菌UA159作為實(shí)驗(yàn)菌株,PCR擴(kuò)增clp P、clp C基因片段,分別插入p MD-19T simple克隆載體,并連入卡那霉素抗性基因盒(lox71-kan-lox66),從而構(gòu)建clp P和clp C缺失同源重組載體p CKX3和p CKX4。(2)在感受態(tài)刺激肽(competence-stimulating peptide,CSP)作用下,將線性化的p CKX3和p CKX4分別轉(zhuǎn)化變異鏈球菌UA159,獲得Dclp C::kan和Dclp P::kan菌株,同樣方法轉(zhuǎn)化熱敏質(zhì)粒p Cre PA,37℃培養(yǎng)去除p Cre PA并獲得無標(biāo)記缺陷株SM-Dclp P和SM-Dclp C。(3)PCR擴(kuò)增clp P基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)及其5’UTR,插入p Ori23并轉(zhuǎn)化SM-Dclp P突變菌株,獲得補(bǔ)償株Sclp P。(4)以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線,觀察各菌株的生長(zhǎng)情況。(5)以p H5.0、6.0、8.0和1%Na Cl、2.5%Na Cl的THY平板進(jìn)行生存測(cè)試,比較各菌株的生存能力。(6)將各菌株分別培養(yǎng)于0.5%葡萄糖的THY液和0.5%蔗糖的THY液48h,蒸餾水洗滌后采用結(jié)晶紫染色并用熒光相差顯微鏡觀察生物膜形成情況;以乙醇:丙酮=8:2的洗滌液進(jìn)行洗脫附著染料并檢測(cè)其A575的吸光度值。(7)利用傳統(tǒng)的KB法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),比較各菌株的適應(yīng)性耐藥情況。(8)在CSP誘導(dǎo)下,將穿梭質(zhì)粒p DL276分別轉(zhuǎn)化S.mutans UA159和Dclp C缺陷株,觀察其感受態(tài)轉(zhuǎn)化率的影響。(9)利用Trizol法分別抽提CSP誘導(dǎo)下各菌株的總RNA,Real-time PCR檢測(cè)感受態(tài)基因com X、cin A、com YA的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)經(jīng)PCR、酶切及DNA測(cè)序證明,成功構(gòu)建同源重組載體p CKX3、p CKX4和變異鏈球菌無標(biāo)記SM-Dclp P和SM-Dclp C缺陷株。(2)經(jīng)PCR和測(cè)序證明,成功構(gòu)建補(bǔ)償質(zhì)粒p CKX5和補(bǔ)償菌株Sclp P。(3)37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件下,SM-Dclp P的生長(zhǎng)速度明顯低于野生株,補(bǔ)償菌株Sclp P的生長(zhǎng)速度介于野生株和SM-Dclp P之間,但并未恢復(fù)到野生株的水平;而42℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件下SM-Dclp C的生長(zhǎng)速度明顯高于野生株,SM-Dclp P生長(zhǎng)明顯低下。(4)菌落數(shù)觀察,clp P缺陷株表現(xiàn)出對(duì)酸堿和氯化鈉的抵抗能力明顯下降;補(bǔ)償菌株的耐酸堿鹽的能力恢復(fù)接近野生株水平。(5)細(xì)菌在蔗糖培養(yǎng)液中的生物膜形成能力明顯強(qiáng)于葡萄糖培養(yǎng)液;在0.5%Glucose THY培養(yǎng)基中clp P缺陷菌株的生物膜形成能力嚴(yán)重受損是野生株的42%;0.5%Sucrose THY培養(yǎng)基中clp P缺陷菌株的生物膜形成能力反而成倍增長(zhǎng)是野生株的1.74倍;clp C基因基本不影響細(xì)菌生物膜的形成。(6)與野生株相比,clp P缺陷株對(duì)抗生素的敏感性增加;clp C缺陷株的抗生素敏感性無明顯變化。(7)CSP誘導(dǎo)下,野生株的感受態(tài)轉(zhuǎn)化增長(zhǎng)速率較快,50min~90min達(dá)到增長(zhǎng)高峰;SM-Dclp C于120min~150min時(shí)達(dá)到最高峰,并且延長(zhǎng)中晚期感受態(tài)細(xì)胞的維持期。(8)經(jīng)Real-time PCR檢測(cè):與野生菌株相比,SM-Dclp P菌株的晚期感受態(tài)基因com YA表達(dá)量上升2.007倍,而cin A、com X分別下降為73%和58.2%;SM-Dclp C的感受態(tài)基因com YA、cin A和com X的表達(dá)量分別上升8.34倍、2.99倍和1.608倍。結(jié)論:Clp蛋白酶在維持變異鏈球菌內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及調(diào)控其致病方面發(fā)揮著重要的作用,參與調(diào)控細(xì)菌形態(tài)的變化、生物膜形成、抗外環(huán)境應(yīng)激、適應(yīng)性耐藥以及感受肽細(xì)胞形成能力等。
【關(guān)鍵詞】：變異鏈球菌 Clp蛋白酶 毒力 感受態(tài)細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378

  本文關(guān)鍵詞：變異鏈球菌ClpCP蛋白酶作用機(jī)制的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：313942