建立基于Cre/loxp重組酶系統(tǒng)調(diào)控的海馬和新皮質(zhì)特異性GABA_A受體γ2亞基（GABRG2）基因條件基因敲除小鼠模型,為深入研究海馬區(qū)和新皮質(zhì)GABRG2在癲癇發(fā)生中的功能作用提供動(dòng)物模型。將引進(jìn)的GABRG2^fl/wt轉(zhuǎn)基因小鼠與海馬和新皮質(zhì)特異性表達(dá)Cre⁺/+重組酶工具鼠分別進(jìn)行繁配和鑒定,然后再將2種小鼠進(jìn)行雜交并對(duì)其子代小鼠的基因型進(jìn)行鑒定,其子代基因型為GABRG2^fl/wtCre⁺的小鼠為構(gòu)建的海馬區(qū)和新皮質(zhì)特異性GABRG2基因條件性敲除小鼠。利用PCR技術(shù)鑒定小鼠基因型,Real-Time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)GABRG2基因在小鼠海馬和新皮質(zhì)中的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。PCR結(jié)果顯示子代小鼠基因型符合GABRG2^fl/wtCre⁺;海馬與新皮質(zhì)特異性GABRG2基因敲除小鼠海馬和新皮質(zhì)中GABRG2的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平顯著低于對(duì)照組;熱造模過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)組小鼠癲癇發(fā)作更明顯。... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)生物工程雜志. 2020,40(03)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

海馬和新皮質(zhì)組織特異性GABRG2基因敲除小鼠構(gòu)建策略

GABRG2fl/wtCre+小鼠鑒定分兩部分，第一部分鑒定GABRG2fl/wt，第二部分鑒定Cre+，二者均為陽(yáng)性則是GABRG2fl/wtCre+基因型試驗(yàn)組小鼠，鑒定PCR引物見(jiàn)表2。鑒定時(shí)除剪腳趾提取基因組DNA外，在獲得的GABRG2fl/wtCre+小鼠中隨機(jī)選擇一只取海馬和新皮質(zhì)，提取基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，鑒定組織flox區(qū)域已經(jīng)刪除。1.2.4 PCR反應(yīng)與瓊脂糖凝膠電泳

對(duì)F0代小鼠與背景鼠回交，繁殖生育F1代，篩選出GABRG2fl/fl小鼠或GABRG2fl/wt小鼠。對(duì)F1代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，部分結(jié)果見(jiàn)圖3，基因型鑒定引物見(jiàn)表1。使用引物1進(jìn)行PCR篩選時(shí)，GARG2 flox純合子小鼠顯示一條248bp條帶，野生型條帶為158bp，雜合子為兩條帶;引物2 PCR擴(kuò)增后，純合子擴(kuò)增片段條帶為294bp，野生型為201bp，雜合子為兩條帶;使用引物3 PCR后，含有flox的小鼠擴(kuò)增條帶為534bp，野生型則無(wú);同樣引物4 PCR后，含有flox的小鼠擴(kuò)增條帶為588bp，野生型則無(wú);分別使用引物5和引物6進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，含flox的小鼠分別擴(kuò)增出1 962bp和2 013bp的條帶，野生型則無(wú)此條帶。同時(shí)滿足此6個(gè)位點(diǎn)鑒定正確的小鼠為本研究使用的目的小鼠。本實(shí)驗(yàn)中所得到的4只小鼠(雌、雄各2只)均為雜合型GABRG2fl/wt小鼠。鑒定過(guò)程中，僅F0代及F1代需鑒定6個(gè)位點(diǎn)并測(cè)序，F(xiàn)1代小鼠后代鑒定方案為5"初篩或3"初篩引物、D5-5引物、D3-3引物，不需測(cè)序。2.2 表達(dá)Cre重組酶小鼠的繁殖及鑒定


本文編號(hào)：3116802