人類多能干細(xì)胞（human pluripotent stem cell,hPSC）包括人胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell,ESC）及人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）,它們具有向人體多種類型細(xì)胞分化的潛能。近年來,其體外定向分化為脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元的研究取得了一定進(jìn)展。該文基于對神經(jīng)發(fā)育的理解,回顧總結(jié)了hPSC向脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元定向分化的研究進(jìn)展,并介紹了它們在研究人類神經(jīng)發(fā)育、對疾病進(jìn)行體外建模和細(xì)胞替代療法方面的應(yīng)用。 

【文章來源】：中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報. 2020,42(08)CSCD

【文章頁數(shù)】：11 頁

【部分圖文】：

中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的前后軸模式化示意圖(根據(jù)參考文獻(xiàn)[2,9]修改)

最早對于脊髓運(yùn)動神經(jīng)元體外分化方法的探索是在小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cell,mESC)中進(jìn)行的[19]。以“活化–轉(zhuǎn)化”學(xué)說為理論依據(jù),mESC先后經(jīng)歷了神經(jīng)誘導(dǎo)、后方化和腹側(cè)化,分化為脊髓MN。其中神經(jīng)誘導(dǎo)通過擬胚體(embryoid body,EB)步驟實(shí)現(xiàn)。EB是mESC在無白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的干細(xì)胞培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng),自發(fā)聚集形成的細(xì)胞團(tuán)。EB包含外、中、內(nèi)三胚層命運(yùn)的細(xì)胞,可在一定程度上模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育過程[20];第2～3天的EB中可檢測到部分SOX1陽性的神經(jīng)上皮細(xì)胞;在第5天,可檢測到神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)、βIII微管蛋白(neuronal class III β-tubulin,TUJ1)雙陽性的神經(jīng)元。而后方化和腹側(cè)化則分別通過添加RA和SHH激活劑實(shí)現(xiàn)。神經(jīng)誘導(dǎo)–后方化–腹側(cè)化這一策略隨后被應(yīng)用到人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell,hESC)的誘導(dǎo)分化中[8]。與mESC相似,早期研究多通過使用撤去成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF-2)的hESC培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)hESC,得到EB[20];隨后應(yīng)用神經(jīng)分化培養(yǎng)基(多含N2)培養(yǎng)EB,可得到PAX6陽性的神經(jīng)上皮細(xì)胞,在貼壁培養(yǎng)條件下,神經(jīng)上皮細(xì)胞呈環(huán)狀排列,被稱為神經(jīng)玫瑰花結(jié)構(gòu)(neural rosette),類似胚胎發(fā)育過程中的神經(jīng)管。早期rosette為PAX6陽性、SOX1陰性;晚期rosette為PAX6、SOX1雙陽性[21]。早期研究多經(jīng)過EB-rosette階段進(jìn)行hESC的神經(jīng)誘導(dǎo),再挑取rosette,運(yùn)用RA及SHH激活劑—包括SHH、hedgehog/smoothened激動劑(hedgehog/smoothened agonist,SAG)與PMN(purmorphamine)進(jìn)行處理,實(shí)現(xiàn)后方化和腹側(cè)化,得到MN。MN在含多種神經(jīng)營養(yǎng)因子[包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcellline-derived neurotrophic factor,GDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)等]的培養(yǎng)液中逐漸成熟(圖3),表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)、NeuN及膽堿能標(biāo)志物ChAT、VAChT,并可發(fā)放動作電位[21-23]。也有部分研究不經(jīng)過EB階段,而采用高密度貼壁培養(yǎng)的方法得到rosette[24-25];或不經(jīng)rosette,在懸浮培養(yǎng)條件下進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)[26-27]。然而,由于人類發(fā)育過程相較小鼠而言十分緩慢,采用這一策略的各種分化方法均耗時較長(約1～2個月),且得到神經(jīng)元的比例普遍偏低(20%～50%)[8]。

盡管SMAD雙抑制劑的運(yùn)用使得脊髓運(yùn)動神經(jīng)元體外分化的效率大大提高,但這一類方法只能將hPSC分化為后腦及脊髓前端運(yùn)動神經(jīng)元,表達(dá)同源盒基因家族靠3?端基因(圖1),而更后方化的神經(jīng)元—包括支配下肢肌肉的腰、骶段神經(jīng)元則無法獲得[8]。而神經(jīng)中胚層前體細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為后方化脊髓的獲得打開了新的途徑。在雞、小鼠及人類胚胎中,這一類細(xì)胞存在于上胚層的后外側(cè)(caudal lateral epiblast,CLE)、毗鄰原條–原節(jié)交界區(qū)(node-streak border,NSB)[4-6],表現(xiàn)為神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物SOX2及中胚層前體標(biāo)志物Brachury(Bra/T)雙陽性,可發(fā)育為軸旁中胚層及后方化的脊髓[35-36]。目前已有多項研究在體外得到了神經(jīng)中胚層前體細(xì)胞,發(fā)育早期Wnt信號通路的激活被認(rèn)為對NMP的形成至關(guān)重要[36]。最早的研究描述了將以FGF-2及Activin維持培養(yǎng)的小鼠上胚層干細(xì)胞(epiblast stem cell,EpiSC)用CHIR處理48 h,可得到一小群Bra、SOX2雙陽性細(xì)胞,同時大部分細(xì)胞為Bra、叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子A2(forkhead box transcription factor A2,FOXA2)雙陽性的中胚層前體細(xì)胞[37]�；虮磉_(dá)分析證實(shí),CHIR導(dǎo)致了Wnt信號通路的激活。隨后的研究將小鼠及人ESC暴露于FGF-2和CHIR,而不用Activin處理,可得到高達(dá)80%的Bra、SOX2雙陽性細(xì)胞。其中將mESC用FGF-2處理2天可得到上胚層樣的細(xì)胞,隨后添加Wnt處理1天,可得到NMP[38]。誘導(dǎo)過程的第2～3天被認(rèn)為是Wnt信號響應(yīng)的窗口期[39]。而hESC的NMP體外誘導(dǎo)方式則與mESC略有不同,多采用FGF-2和CHIR聯(lián)合處理3天的方式,CHIR在誘導(dǎo)的第0天開始添加直至第3天[2]。除此之外,有研究通過從第0天撤去FGF-2,在1～3天添加FGF8b,2～3天添加CHIR,可在第3天得到接近100%的NMP,并可在體外維持最多7天[40];亦有研究不添加FGF-2,而運(yùn)用SB431542及CHIR處理hESC,在第4天得到了表達(dá)后方化神經(jīng)標(biāo)志物及中胚層標(biāo)志物的“后方前體細(xì)胞”(caudal progenitor cell)[41]。


本文編號：3109809