Tudor-SN通過調(diào)控染色質(zhì)重塑促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的分子機(jī)制
發(fā)布時(shí)間：2021-03-25 22:26
目的:人體在自然條件下,會(huì)被環(huán)境中各種刺激因素以及細(xì)胞內(nèi)源性應(yīng)激造成DNA發(fā)生損傷,嚴(yán)重影響了細(xì)胞內(nèi)信息遺傳和基因編碼的方式。在遭受刺激后,細(xì)胞會(huì)通過激活一套完整精細(xì)的過程,包括DNA斷裂識(shí)別,檢查點(diǎn)的激活,染色質(zhì)重塑,DNA修復(fù),周期阻滯和細(xì)胞凋亡等,防止錯(cuò)誤信息影響細(xì)胞自身功能,維護(hù)基因組的穩(wěn)定性,保護(hù)機(jī)體功能的正常運(yùn)行。Tudor-SN（Tudor staphylococcal nuclease）作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄共激活因子,在很多細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮作用,比如:pre-mRNA剪接加工,細(xì)胞周期調(diào)控,應(yīng)激顆粒形成,脂質(zhì)代謝,腫瘤侵襲遷移等。近期研究報(bào)道,Tudor-SN與細(xì)胞凋亡以及化療藥物抵抗密切相關(guān)。我們實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果也發(fā)現(xiàn)Tudor-SN可以與一些損傷修復(fù)蛋白結(jié)合,但其作用和具體機(jī)制尚不明確。本課題主要目的是探討Tudor-SN在DNA損傷修復(fù)中的功能及其分子機(jī)制。方法:本課題主要分六部分進(jìn)行:第一部分,在不同細(xì)胞系中觀察Tudor-SN與損傷修復(fù)蛋白的結(jié)合情況。首先采用質(zhì)譜技術(shù),在IR后用Tudor-SN蛋白釣取損傷修復(fù)相關(guān)蛋白,然后在Hela和MEF細(xì)胞中利用免疫共沉淀方法進(jìn)一步...
【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校
【文章頁數(shù)】：119 頁
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【部分圖文】：
1：Tudor-SN與多種損傷修復(fù)蛋白結(jié)合為了進(jìn)一步確認(rèn)Tudor-SN在質(zhì)譜中的釣取結(jié)果，我們?cè)贛EF和HeLa細(xì)胞
圖 2.1.2：Tudor-SN 與多種損傷修復(fù)蛋白內(nèi)源性結(jié)合Tudor-SN 在 IR 后細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用細(xì)胞在遭受 DNA 損傷后會(huì)激活體內(nèi)各種修復(fù)機(jī)制，保護(hù)自身基因組的待修復(fù)完成后，重新進(jìn)入周期存活下去，但是如果不能很好的修復(fù)則最后死亡，前面的結(jié)果提示我們 Tudor-SN 可以與多種損傷修復(fù)蛋白結(jié)作為一個(gè)新的損傷修復(fù)蛋白，那 Tudor-SN 的缺失是否會(huì)導(dǎo)致 IR 后細(xì)發(fā)生改變？為了檢測(cè)Tudor-SN 在細(xì)胞IR后的生理功能，我們利用MEF-WT和ME系，用 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在 IR 后的存活率。如結(jié)果所示，首先用 weting 驗(yàn)證 MEF-WT 和 MEF-KO 細(xì)胞中 Tudor-SN 的表達(dá)，結(jié)果顯示 KOor-SN 蛋白被完全敲除，接下來將兩組細(xì)胞分別給予不同劑量（0，2，4）IR 照射，然后用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，取 5000 個(gè)細(xì)胞鋪 96 孔板， 5 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)三天后，利用 MTT 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的活性，
圖 2.2.1：Tudor-SN 敲除，MEF-KO 細(xì)胞在 IR 后存活率降低為了進(jìn)一步確認(rèn) Tudor-SN 是否會(huì)影響細(xì)胞對(duì)IR的敏感性，我們用MEF-WT和 MEF-KO 細(xì)胞，給予不同劑量（0，2，3，4，5Gy）IR 照射后，用胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸浮液，每皿取 5000 個(gè)細(xì)胞鋪于 6cm皿中培養(yǎng) 10-14 天，當(dāng)發(fā)現(xiàn)肉眼可見克隆斑后，清洗培養(yǎng)皿，固定細(xì)胞后用結(jié)晶紫染色，隨后洗凈拍照，并在顯微鏡下觀察克隆斑的形成并計(jì)數(shù)。我們將未照射組的細(xì)胞克隆數(shù)量設(shè)定為 1，同樣算法計(jì)算出其他每皿細(xì)胞克隆斑的比例，根據(jù)克隆斑比例做折線圖，統(tǒng)計(jì)分析各組間差異。結(jié)果顯示兩組細(xì)胞中，MEF-WT 組細(xì)胞在 IR 后隨著劑量的增加，克隆斑的形成有減少，而 MEF-KO 組中隨著 IR 劑量增加，克隆斑數(shù)量減少更明顯，提示我們MEF-KO 組細(xì)胞IR后活性較低，克隆形成能力明顯較弱，根據(jù)克隆斑比率計(jì)算成活率，采用 t 檢驗(yàn)分析，*P<0.05 (n=3)，**P<0.01 (n=3統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著差異。這說明Tudor-SN 敲除后細(xì)胞對(duì)IR照射更敏感（圖2.2.2）。
本文編號(hào)：3100437
【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校
【文章頁數(shù)】：119 頁
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【部分圖文】：
1：Tudor-SN與多種損傷修復(fù)蛋白結(jié)合為了進(jìn)一步確認(rèn)Tudor-SN在質(zhì)譜中的釣取結(jié)果，我們?cè)贛EF和HeLa細(xì)胞
圖 2.1.2：Tudor-SN 與多種損傷修復(fù)蛋白內(nèi)源性結(jié)合Tudor-SN 在 IR 后細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用細(xì)胞在遭受 DNA 損傷后會(huì)激活體內(nèi)各種修復(fù)機(jī)制，保護(hù)自身基因組的待修復(fù)完成后，重新進(jìn)入周期存活下去，但是如果不能很好的修復(fù)則最后死亡，前面的結(jié)果提示我們 Tudor-SN 可以與多種損傷修復(fù)蛋白結(jié)作為一個(gè)新的損傷修復(fù)蛋白，那 Tudor-SN 的缺失是否會(huì)導(dǎo)致 IR 后細(xì)發(fā)生改變？為了檢測(cè)Tudor-SN 在細(xì)胞IR后的生理功能，我們利用MEF-WT和ME系，用 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在 IR 后的存活率。如結(jié)果所示，首先用 weting 驗(yàn)證 MEF-WT 和 MEF-KO 細(xì)胞中 Tudor-SN 的表達(dá)，結(jié)果顯示 KOor-SN 蛋白被完全敲除，接下來將兩組細(xì)胞分別給予不同劑量（0，2，4）IR 照射，然后用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，取 5000 個(gè)細(xì)胞鋪 96 孔板， 5 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)三天后，利用 MTT 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的活性，
圖 2.2.1：Tudor-SN 敲除，MEF-KO 細(xì)胞在 IR 后存活率降低為了進(jìn)一步確認(rèn) Tudor-SN 是否會(huì)影響細(xì)胞對(duì)IR的敏感性，我們用MEF-WT和 MEF-KO 細(xì)胞，給予不同劑量（0，2，3，4，5Gy）IR 照射后，用胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸浮液，每皿取 5000 個(gè)細(xì)胞鋪于 6cm皿中培養(yǎng) 10-14 天，當(dāng)發(fā)現(xiàn)肉眼可見克隆斑后，清洗培養(yǎng)皿，固定細(xì)胞后用結(jié)晶紫染色，隨后洗凈拍照，并在顯微鏡下觀察克隆斑的形成并計(jì)數(shù)。我們將未照射組的細(xì)胞克隆數(shù)量設(shè)定為 1，同樣算法計(jì)算出其他每皿細(xì)胞克隆斑的比例，根據(jù)克隆斑比例做折線圖，統(tǒng)計(jì)分析各組間差異。結(jié)果顯示兩組細(xì)胞中，MEF-WT 組細(xì)胞在 IR 后隨著劑量的增加，克隆斑的形成有減少，而 MEF-KO 組中隨著 IR 劑量增加，克隆斑數(shù)量減少更明顯，提示我們MEF-KO 組細(xì)胞IR后活性較低，克隆形成能力明顯較弱，根據(jù)克隆斑比率計(jì)算成活率，采用 t 檢驗(yàn)分析，*P<0.05 (n=3)，**P<0.01 (n=3統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著差異。這說明Tudor-SN 敲除后細(xì)胞對(duì)IR照射更敏感（圖2.2.2）。
本文編號(hào)：3100437
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