乙型肝炎病毒核心蛋白HBc,可在體外自組裝形成二十面體對稱結(jié)構(gòu)的病毒樣微粒VLPs。VLPs可將外源序列重復(fù)且高密度地展示在表面,VLPs進(jìn)入機(jī)體后能夠快速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對外源性抗原的特異性體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答,具有極強(qiáng)的免疫原性與生物活性。因此,HBc-VLPs可以作為一種安全、有效的疫苗載體。文中設(shè)計(jì)了一種能夠?qū)崿F(xiàn)與抗原定點(diǎn)偶聯(lián)的HBc-VLPs,并開發(fā)了一套高效制備HBc-VLPs的方法。通過定點(diǎn)突變技術(shù),使翻譯后的多肽序列第80位氨基酸由Ala變?yōu)镃ys,在HBc-VLPs的主要免疫顯性區(qū)域引入一個(gè)定點(diǎn)交聯(lián)位點(diǎn),構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a（+）-hbc,表達(dá)、純化獲得了高純度的HBc（A80C）單體蛋白;在PB緩沖體系中,HBc（A80C）蛋白自組裝形成HBc-VLPs納米粒子。粒度儀的測定結(jié)果表明,HBc-VLPs納米微粒的平均粒徑為29.8 nm,透射電子顯微鏡觀察到HBc-VLPs形成粒徑約為30 nm的球形微粒,其形態(tài)與天然的HBV微粒相似。以流感病毒M2e抗原肽為模式抗原,通過Sulfo-SMCC氨基-巰基雙功能交聯(lián)劑,將M2e定點(diǎn)連接于HBc-VLPs通過突變... 

【文章來源】：生物工程學(xué)報(bào). 2020,36(07)北大核心

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pET28a(+)-hbc重組質(zhì)粒的構(gòu)建

選取6–8周齡的BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)分配到籠內(nèi)，每組6只。將M2e-HBc-VLPs、未交聯(lián)的M2e抗原肽分別對不同組內(nèi)的小鼠進(jìn)行皮下注射，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)50μg或100μg/只，空白對照組注射相同體積的無抗原緩沖液作為陰性對照。初次免疫后，間隔2周免疫1次，共免疫3次。動物實(shí)驗(yàn)依照3R原則，并給予相應(yīng)的人道關(guān)懷。1.1 0 免疫動物血清中抗原特異抗體的檢測

以公司合成的包含hbc基因完整序列的質(zhì)粒為模板，用相應(yīng)的引物進(jìn)行點(diǎn)突變并擴(kuò)增hbc基因序列，重疊延伸PCR反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增出兩條明亮、單一的條帶，電泳結(jié)果如圖3所示，在500 bp附近處出現(xiàn)單一、明亮的條帶，這與理論大小469 bp(含酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿基)相符，擴(kuò)增序列正確。經(jīng)過酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟后，菌液PCR驗(yàn)證目標(biāo)序列的載入，測序顯示載入序列與理論序列完全一致，序列中238–240位已從GCA突變?yōu)門GT，說明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-hbc構(gòu)建成功。在重組載體設(shè)計(jì)之初，我們就將表達(dá)HBc蛋白C末端150–183位氨基酸的基因序列除去，僅保留了1–149位氨基酸的基因序列。研究表明150–183位氨基酸對顆粒的形成和衣殼的大小與形態(tài)的維持是非必需的，除去HBc蛋白C末端含有病毒衣殼RNA/DNA結(jié)合位點(diǎn)的150–183殘基序列，能夠防止RNA/DNA與病毒衣殼結(jié)合[21]，且大多數(shù)149殘基衣殼肽鏈經(jīng)大腸桿菌表達(dá)都會組裝形成T=4型微粒[22]。這樣的設(shè)計(jì)保證了顆粒的均一性，并且T=4型微粒的結(jié)構(gòu)與天然的HBV衣殼一致。在HBc肽鏈的1–149位氨基酸中含有3個(gè)半胱氯酸殘基，位置分別位于48、61、107位。48位Cys與61位Cys通常參與鏈間二硫鍵的形成，107位Cys被埋藏于核心顆粒的內(nèi)部[23],3個(gè)位點(diǎn)都不是抗原肽結(jié)合的最佳位置。而78–82位氨基酸位于病毒微粒表面突起的頂部，是HBc的主要免疫顯性區(qū)域[17]，是抗原肽交聯(lián)的最佳區(qū)域，因此，選取此區(qū)域引入半胱氨酸殘基。78位到82位的氨基酸分別為78天冬氨酸(Asp)、79脯氨酸(Pro)、80丙氨酸(Ala)、81絲氨酸(Ser)、82精氨酸(Arg)，通過分析5個(gè)氨基酸的理化性質(zhì)，以及氨基酸改變后對蛋白結(jié)構(gòu)的影響，將80位丙氨酸變?yōu)榘腚装彼釒淼慕Y(jié)構(gòu)改變最小，是最佳的選擇(圖4)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]由乙肝病毒核心蛋白（HBc-VLP）遞載的流感通用疫苗Flu@uV設(shè)計(jì)構(gòu)建、表征及初步活性研究[J]. 張旭凡,胡發(fā)彪,馬興元,王天文,王平,王曉麗.  中國生物工程雜志. 2016(02)
[2]M2e-HBC融合蛋白的真核表達(dá)[J]. 劉蕊,李志奎.  陜西醫(yī)學(xué)雜志. 2011(09)



本文編號：3058853