發(fā)布時間：2021-02-22 02:18

　　[目的]構建細胞周期依賴性蛋白激酶9（CDK9）的真核表達載體pEnter-CDK9-His,利用HEK 293T真核表達系統(tǒng)表達CDK9蛋白并驗證其與TP53蛋白之間的相互作用。[方法]利用聚合酶鏈反應從Hela細胞中擴增出CDK9靶基因序列,并將擴增出的CDK9基因片段通過無縫克隆技術克隆至pEnter載體上,經(jīng)過PCR和一代測序驗證插入位置正確且無突變后轉染至人胚腎HEK 293T細胞,利用GST-pulldown技術檢測本研究所表達的CDK9蛋白與TP53蛋白之間的相互作用。[結果]重組質粒pEnter-CDK9-His的插入基因序列與目的序列完全一致,蛋白免疫印跡檢測到融合蛋白表達; GST-pulldown實驗證實了CDK9蛋白與TP53蛋白存在直接的相互作用。[結論]成功構建了人CDK9基因的真核表達載體pEnter-CDK9-His,證實了所表達的CDK9融合蛋白與TP53蛋白存在著直接的相互作用,具有一定的生物學功能,為進一步研究CDK9和TP53在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及治療過程中發(fā)揮的功能奠定了基礎。 

【文章來源】：生物技術. 2020,30(03)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

CDK9基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

重組質粒p Enter-CDK9的PCR鑒定圖

分別將重組質粒p Enter-CDK9-His和空載體pEnter轉染HEK 293T真核表達細胞，轉染48 h之后收集細胞制作樣品利用免疫印跡法檢測CDK9的表達。結果可見，轉染重組質粒pEnter-CDK9-His的實驗組可觀察到一相對分子質量與CDK9蛋白相對分子質量理論值42 k Da符合的條帶，而pEnter對照組的泳道未觀察到特異性條帶。圖4 CDK9蛋白與TP53蛋白存在直接的相互作用


本文編號：3045288