[目的]構(gòu)建細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶9（CDK9）的真核表達(dá)載體pEnter-CDK9-His,利用HEK 293T真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CDK9蛋白并驗證其與TP53蛋白之間的相互作用。[方法]利用聚合酶鏈反應(yīng)從Hela細(xì)胞中擴增出CDK9靶基因序列,并將擴增出的CDK9基因片段通過無縫克隆技術(shù)克隆至pEnter載體上,經(jīng)過PCR和一代測序驗證插入位置正確且無突變后轉(zhuǎn)染至人胚腎HEK 293T細(xì)胞,利用GST-pulldown技術(shù)檢測本研究所表達(dá)的CDK9蛋白與TP53蛋白之間的相互作用。[結(jié)果]重組質(zhì)粒pEnter-CDK9-His的插入基因序列與目的序列完全一致,蛋白免疫印跡檢測到融合蛋白表達(dá); GST-pulldown實驗證實了CDK9蛋白與TP53蛋白存在直接的相互作用。[結(jié)論]成功構(gòu)建了人CDK9基因的真核表達(dá)載體pEnter-CDK9-His,證實了所表達(dá)的CDK9融合蛋白與TP53蛋白存在著直接的相互作用,具有一定的生物學(xué)功能,為進(jìn)一步研究CDK9和TP53在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及治療過程中發(fā)揮的功能奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：生物技術(shù). 2020,30(03)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

CDK9基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

重組質(zhì)粒p Enter-CDK9的PCR鑒定圖

分別將重組質(zhì)粒p Enter-CDK9-His和空載體pEnter轉(zhuǎn)染HEK 293T真核表達(dá)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h之后收集細(xì)胞制作樣品利用免疫印跡法檢測CDK9的表達(dá)。結(jié)果可見，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEnter-CDK9-His的實驗組可觀察到一相對分子質(zhì)量與CDK9蛋白相對分子質(zhì)量理論值42 k Da符合的條帶，而pEnter對照組的泳道未觀察到特異性條帶。圖4 CDK9蛋白與TP53蛋白存在直接的相互作用


本文編號：3045288