目的（1）探討miR-219a-5p在etoposide損傷及H₂O₂損傷細胞模型中的表達情況;（2）利用生物信息學(xué)篩選出CCNA2和CACUL1是miR-219a-5p的靶蛋白,并探討蛋白CCNA2和CACUL1在etoposide損傷及H₂O₂損傷模型中的變化趨勢;（3）驗證蛋白CCNA2和CACUL1是miR-219a-5p的靶蛋白;（4）探尋特異變化的miR-219a-5p在TBI過程中的作用機制,以期為TBI患者的診斷和治療提供新思路與新方法。方法（1）采用25μmol/L etoposide刺激損傷神經(jīng)元細胞,并收集在1h,6h,16h,20h,24h時損傷的神經(jīng)元細胞及對照組細胞內(nèi)的總RNA。另外,采用150μmol/L H₂O₂損傷神經(jīng)元細胞,并提取在6h,12h,18h,24h時損傷的神經(jīng)元細胞及對照組細胞內(nèi)的總RNA。實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(yīng)（quantitative Real-time polymerase chain reac... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

pMIR-REPORT熒光素酶質(zhì)粒示意圖

17圖 2-2 β-半乳糖苷酶表達質(zhì)粒示意圖經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)染過表達或抑制實驗研究 miR-219a-5p 與靶基因 CCNA2 和 CACUL1 的關(guān)系，我們通過ctamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染 miR-219a-5p agomir 和 antagomir 及其對照司合成）的方法，人為過表達或者降低 miR-219a-5p 在神經(jīng)細胞內(nèi)的miR-219a-5p agomir 是根據(jù) miR-219a-5p 成熟體序列設(shè)計的雙鏈用于模擬內(nèi)源性成熟體 miR-219a-5p 序列，從而上調(diào) miR-219a-5p19a-5p antagomir 是根據(jù) miR-219a-5p 成熟體序列設(shè)計的一段反義，用于抑制細胞內(nèi) miR-219a-5p 的活性。本實驗細胞轉(zhuǎn)染步驟如下

實驗結(jié)果1 原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的鑒定原代皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)體外培養(yǎng)大約 3 天后，呈紡錘形，部分呈橢圓形或三角形，樹突和軸突明顯；培養(yǎng)第七天時，胞體遮光性強、立體感好，形態(tài)飽滿，樹突軸突更豐富，相互交織成網(wǎng)絡(luò)狀。為了鑒定皮質(zhì)神經(jīng)元的純度，我們采用 MAP2抗體進行了免疫細胞化學(xué)實驗。熒光顯微鏡結(jié)果顯示呈綠色熒光的部位是神經(jīng)元細胞質(zhì)和樹突，表示 MAP2 蛋白表達陽性。DAPI 可與雙鏈 DNA 結(jié)合，陽性表現(xiàn)為細胞核呈藍色熒光；計算同一視野下 DAPI 染色陽性的細胞中 MAP2 也呈陽性的神經(jīng)元所占的百分比，結(jié)果顯示：MAP2 和 DAPI 雙染色均為陽性的神經(jīng)元所占百分比達 95%以上，說明所培養(yǎng)的原代神經(jīng)元純化良好。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Toll樣受體4信號通路研究進展[J]. 蔡炳岡,朱進,汪茂榮.  醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報. 2015(11)
[2]脂質(zhì)相關(guān)miRNA研究進展[J]. 劉婷,王靜,汪俊軍.  臨床檢驗雜志. 2014(07)



本文編號：3044777