人3型腺病毒在人DSG2受體轉基因鼠體內復制及侵染等生命過程尚不清楚。本研究旨在構建含螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase,Fluc）報告基因的復制型重組人3型腺病毒,為可視化重組人3型腺病毒的應用奠定基礎。通過PCR擴增螢火蟲熒光素酶報告基因,克隆入去掉EGFP基因的人3型腺病毒穿梭質粒pSKA3E3LR（EGFP）,經雙酶切后與人3型腺病毒骨架質粒pBRAd3-EGFP的PCR擴增片段經重組酶Exnase體外重組的方法,得到中間載體,最后與pBRAd3-EGFP酶切片段連接,得到重組腺病毒質粒pAd3-LUC;轉染AD293細胞,將包裝成功的重組腺病毒rAd3-LUC純化并免疫動物,分析重組腺病毒的特性和在小鼠體內的免疫反應。結果顯示采用體外重組、酶切連接等方法成功獲得到重組人3型腺病毒質粒pAd3-LUC,線性化的pAd3-LUC轉染AD293細胞包裝拯救得到重組腺病毒rAd3-LUC,觀察到細胞病變和檢測到熒光素酶的穩(wěn)定表達,rAd3-LUC免疫小鼠抗血清可以識別并中和重組腺病毒rAd3-LUC（滴度約128～256）。本研究成功構建了E3區(qū)缺失并嵌入熒光素酶的... 

【文章來源】：病毒學報. 2020,36(04)北大核心

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重組克隆pAd3-LUC的構建策略

用HAdV‐3的hexon基因的特異引物對（Hexon‐AdV3‐F/Hexon‐AdV3‐R）以及熒光素酶基因的特異引物對（Luc2u/Luc2r）進行PCR鑒定（圖3A、3B），并且測序結果顯示，正確的熒光素酶基因插入重組腺病毒內，EGFP基因被成功替換。將陽性克隆pAd3‐LUC抽提質粒后，用內切酶Bam HI單酶切以及Xba I和Not I雙酶切鑒定（圖3C），并與理論酶切圖譜（圖3D）比較，結果證實獲得基因組正確的陽性重組克隆pAd3‐LUC。3重組腺病毒質粒pAd3-LUC的包裝和純化

測序和酶切鑒定為陽性的重組腺病毒質粒經內切酶Asi SI酶切線性化后，用Liopfectamine?3000轉染試劑轉染AD293細胞，培養(yǎng)5～8d。連續(xù)盲傳4代后出現CPE，第五代后CPE典型，提取重組腺病毒基因組進行PCR擴增確定含有熒光素酶基因，并測序證明熒光素酶基因仍正確插入重組人3型腺病毒。熒光顯微鏡下觀察并沒有發(fā)現綠色熒光，說明EGPF基因基本被切除。拯救得到的重組腺病毒rAd3‐LUC大量培養(yǎng)（30～40個100mm皿）后進行CsCl不連續(xù)密度梯度離心純化，獲得約9.2×1012VPs重組腺病毒粒子。純化的重組腺病毒rAd3‐LUC進行SDS‐PAGE檢測分析（圖4），病毒hexon蛋白條帶正常。4重組腺病毒rAd3-LUC的特性分析

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3027340