本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:體外培養(yǎng)分離純化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),觀察其生長情況及形態(tài),并檢測(cè)其表面標(biāo)志物;探索白藜蘆醇(Resveratrol)在不同濃度下體外定向誘導(dǎo)hUC-MSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的條件及作用;觀察其形態(tài)學(xué)改變,檢測(cè)其基因與蛋白表達(dá)水平;為其將來參與基礎(chǔ)與臨床治療提供新的理論支持和技術(shù)保證。方法:取剖宮產(chǎn)健康足月胎兒的臍帶,剔除臍動(dòng)脈和臍靜脈后用D-Hank’s充分沖洗,將獲得的臍帶間質(zhì)組織分為大約1mm3大小的組織塊,用0.2%膠原酶Ⅱ消化,放入含有20%胎牛血清(FBS)、2 ng/ml表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、25 m M左旋谷氨酰胺(L-Glu)、100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12中培養(yǎng)。觀察獲得的原代細(xì)胞的形態(tài)及生長趨勢(shì),當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)約80%~90%時(shí),加入0.25%胰酶-1m M EDTA消化細(xì)胞,并傳代。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)消化細(xì)胞的細(xì)胞表型,包括CD105、CD73、CD90、CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II),用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對(duì)照。取原代hUC-MSCs按1:1傳代,記為P1代,倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長變化情況,當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到90%以上時(shí),根據(jù)細(xì)胞生長狀況按1:2或1:3比例進(jìn)行傳代,繪制細(xì)胞生長曲線。將處于對(duì)數(shù)生長期增殖迅速的P5代hUC-MSCs傳代至六孔板及25cm2塑料培養(yǎng)瓶中,使用全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)約70%-80%時(shí),隨機(jī)將1個(gè)六孔板及3個(gè)培養(yǎng)瓶組合為1組,分為四組,前三組作為實(shí)驗(yàn)組,第四組為對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組分別為7.5mg/L、15mg/L、30mg/L的白藜蘆醇(Resveratrol)誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)液均用無血清L-DMEM培養(yǎng)基配制,各組中六孔板每孔含誘導(dǎo)液2ml,每培養(yǎng)瓶中含誘導(dǎo)液4ml,對(duì)照組只加無血清L-DMEM培養(yǎng)基,將各組置于CO_2培養(yǎng)箱(CO_2 5%,37℃)中誘導(dǎo),培養(yǎng)條件同前,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,并于各組中隨機(jī)選取10個(gè)非重疊視野,拍照記錄視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)及神經(jīng)樣細(xì)胞的數(shù)量,計(jì)算神經(jīng)樣細(xì)胞在視野內(nèi)所占的比例,結(jié)果以(?)±s表示。四組中誘導(dǎo)于六孔板的細(xì)胞于誘導(dǎo)后第4小時(shí)終止誘導(dǎo),采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)各組細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)情況。然后選取較合適的濃度,使誘導(dǎo)于培養(yǎng)瓶的細(xì)胞分別于誘導(dǎo)后2、4、6、12、24小時(shí)棄去誘導(dǎo)液,用PBS洗滌3次,用Western blot及RT-PCR的方法檢測(cè)各組細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)情況。結(jié)果:原代hUC-MSCs傳代培養(yǎng)12h后,大多數(shù)細(xì)胞貼壁生長,細(xì)胞呈梭形或三角形,隨培養(yǎng)時(shí)間增加,細(xì)胞增殖迅速,貼壁數(shù)量明顯增多,形狀變大,呈長梭形排列。傳代至第5d可見細(xì)胞呈完全融合狀態(tài),以螺旋狀或放射狀方式排列生長。此后可以按照1:2或1:3的比例進(jìn)行消化傳代進(jìn)行新一輪的培養(yǎng),如果沒有傳代并且繼續(xù)培養(yǎng)的活細(xì)胞在貼壁的基礎(chǔ)上會(huì)呈螺旋重疊樣生長,導(dǎo)致局部密度增高。連續(xù)傳代培養(yǎng)多次后仍具有較強(qiáng)的增殖能力。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P2、P5及P10代細(xì)胞的細(xì)胞表型,均表達(dá)CD105、CD73及CD90,不表達(dá)CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II)。加入誘導(dǎo)液培養(yǎng),15mg/L組誘導(dǎo)1h后細(xì)胞未見明顯形態(tài)及外觀變化,4h后極個(gè)別細(xì)胞胞體略微收縮,折光性稍顯增強(qiáng),未見突起,并且有少量細(xì)胞脫離瓶壁,但未完全脫離漂浮,6h后胞體收縮的細(xì)胞數(shù)量略顯增多,折光性明顯增強(qiáng),呈橢圓形或類圓形,伸出兩條或多條長短及粗細(xì)不一的細(xì)長條突起,突起有分支,數(shù)量不等,多數(shù)為雙極細(xì)胞,此時(shí)視野中神經(jīng)樣細(xì)胞比率僅為5%左右。12h時(shí)神經(jīng)樣細(xì)胞未見明顯增多甚至減少,且存在少量漂浮細(xì)胞;30mg/L組誘導(dǎo)1h后神經(jīng)樣細(xì)胞陽性率可達(dá)50%,多級(jí)分化細(xì)胞數(shù)量較15mg/L組驟增,細(xì)胞突起及分支更長,數(shù)量更多,各個(gè)細(xì)胞之間借助伸出的突起及其分支相互交織成網(wǎng)狀,4h時(shí)陽性細(xì)胞比例增加至70%左右,僅見極個(gè)別細(xì)胞漂浮,6h后可見神經(jīng)樣細(xì)胞占視野85%-90%,漂浮細(xì)胞較之前稍顯增多,12h后神經(jīng)樣細(xì)胞比率無明顯增加,且漂浮細(xì)胞數(shù)量增多,24h神經(jīng)樣細(xì)胞比例已經(jīng)降低至70%-80%,漂浮細(xì)胞及未完全脫離瓶底的擺動(dòng)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多;7.5mg/L組與空白對(duì)照組誘導(dǎo)前后相比較無明顯改變,且7.5mg/L組有少量細(xì)胞漂浮。當(dāng)誘導(dǎo)4h時(shí),免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)結(jié)果為15mg/L組和30mg/L組細(xì)胞陽性表達(dá)Nestin和NSE,GFAP為陰性,陽性細(xì)胞可見棕黃色的胞體及紫色胞核。30mg/L組細(xì)胞隨時(shí)間誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細(xì)胞比率均高于其他組。Western blot及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示各組GFAP的蛋白及m RNA表達(dá)均為陰性。Nestin和NSE的蛋白及m RNA在空白組均有少量表達(dá),Nestin蛋白及m RNA隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長而顯著提升,誘導(dǎo)4h時(shí)最高,之后降低。NSE蛋白及m RNA隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長逐漸增加,到6h時(shí)為最高,其后逐漸降低。結(jié)論:hUC-MSCs從人臍帶中分離純化后能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)及傳代,并維持較高的活性;傳代培養(yǎng)的hUC-MSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表型CD105、CD73及CD90,不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II);Resveratrol在一定濃度下可以在體外有效地將hUC-MSCs誘導(dǎo)分化成神經(jīng)樣細(xì)胞,30mg/L為其相對(duì)合適的誘導(dǎo)濃度,表達(dá)巢蛋白(Nestin)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE),不表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。
【關(guān)鍵詞】：白藜蘆醇 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 誘導(dǎo) 神經(jīng)樣細(xì)胞 免疫組織化學(xué)染色 RT-PCR Western blot
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-26
• 結(jié)果26-29
• 附圖29-39
• 附表39-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 綜述 臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究50-60
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 致謝60-61
• 個(gè)人簡歷61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號(hào)：301181