本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白Rv2629及Rv1736c的HLA-A2限制性CTL表位的預(yù)測與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核病是全世界范圍內(nèi)威脅人類健康的主要傳染性疾病之一,全球有近1/3的人感染了結(jié)核分枝桿菌(M.tb),潛伏感染者若不進(jìn)行治療,約有5%-10%的人會在其一生中發(fā)展成活動性結(jié)核病。潛伏感染者已成為結(jié)核病患者的重要來源。目前結(jié)核潛伏感染(LTBI)缺乏統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)和方法,現(xiàn)有的診斷方法也不能將結(jié)核活動性感染與潛伏感染區(qū)分開來,亦缺乏有效的預(yù)防干預(yù)措施,因此,LTBI早期診斷技術(shù)的突破和新型疫苗的研發(fā)成為當(dāng)前結(jié)核病控制中面臨的重要挑戰(zhàn)。隨著對LTBI研究的深入,已發(fā)現(xiàn)某些潛伏感染相關(guān)蛋白在潛伏感染者不發(fā)病的過程中可能具有免疫保護(hù)作用,這些潛伏感染蛋白有可能成為新型的潛伏感染診斷標(biāo)志物及潛伏感染疫苗的候選靶標(biāo),為潛伏感染的診斷及治療提供新的思路。M.tb Rv2629和Rv1736c蛋白是LTBI缺氧相關(guān)蛋白,目前研究雖然顯示二者均可體外刺激結(jié)核病患者的全血產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,但這兩種蛋白的免疫學(xué)特性尚不清楚,在抗結(jié)核免疫中可能發(fā)揮的作用尚需進(jìn)一步研究。本研究對Rv2629蛋白和Rv1736c蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測和分析,并對其HLA-A2限制性CTL表位進(jìn)行鑒定,研究其免疫原性,為研發(fā)潛伏感染的免疫診斷試劑和新型疫苗奠定基礎(chǔ)。一、M.tb Rv2629蛋白和Rv1736c蛋白的抗原表位的預(yù)測應(yīng)用DNAStar軟件包中Protean軟件對Rv2629蛋白和Rv1736c蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析,綜合考慮其二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、表面可能性、肽鏈骨架柔韌性等多參數(shù)預(yù)測其B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位。結(jié)果顯示Rv2629蛋白和Rv1736c蛋白具有較多抗原指數(shù)較高區(qū)段,預(yù)測Rv2629蛋白的B細(xì)胞表位可能位于22-27、39-51、63-74、100-103、112-119、161-177、199-215、226-236、242-252、345-354、364-374位氨基酸殘基,Rv1736c蛋白的潛在B細(xì)胞表位可能位于4-11、35-42、82-105、112-124、151-167、191-199、244-255、268-273、331-338、347-361、447-457、526-532、637-652位氨基酸殘基。應(yīng)用SYFPEITHI和RANKPEP兩種在線軟件預(yù)測其Th細(xì)胞表位,結(jié)果顯示Rv2629蛋白可能有20個(gè)潛在的Th表位,Rv1736c蛋白可能有40個(gè)潛在的Th表位。應(yīng)用SYFPEITHI法、BIMAS法和Net CTL法預(yù)測其CTL表位,經(jīng)初步預(yù)測,選取部分得分較高的野生型候選表位進(jìn)行氨基酸替換,共預(yù)測Rv2629的HLA-A2、HLA-A3和HLA-B7三種表型的CTL表位共15個(gè),其中HLA-A2限制性CTL表位12個(gè),Rv1736c的這三種表型的CTL表位共23個(gè),其中HLA-A2限制性CTL表位13個(gè)。經(jīng)過預(yù)測,Rv2629蛋白的T細(xì)胞候選表位占預(yù)測表位總數(shù)的76.1%,Rv1736c蛋白的T細(xì)胞候選表位占預(yù)測表位總數(shù)的82.9%,這兩個(gè)蛋白均是T細(xì)胞表位占優(yōu)勢的抗原。二、M.tb Rv2629和Rv1736c蛋白抗原的候選HLA-A2限制性CTL表位多肽的合成預(yù)測的25個(gè)候選HLA-A2限制性CTL表位多肽用固相合成法合成,合成的多肽經(jīng)高效液相色譜分析,純度≥95%。三、M.tb Rv2629和Rv1736c蛋白抗原的候選HLA-A2限制性CTL表位與HLA-A2分子結(jié)合的親和力和穩(wěn)定性的測定候選表位與T2細(xì)胞共孵育,用FITC標(biāo)記的HLA-A2抗體標(biāo)記T2細(xì)胞分子表面的HLA-A2分子,通過流式細(xì)胞儀檢測平均熒光強(qiáng)度(MFI),計(jì)算熒光指數(shù)(FI),FI1.5表示高親和力,1.0FI≤1.5表示中等親和力,FI≤1.0表示低親和力;親和力高的候選表位與T2細(xì)胞共孵育,孵育完成后分別于0、2、4、6小時(shí)加入抗HLA-A2抗體,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測MFI,計(jì)算t=0時(shí)的MFI減弱到50%所需的時(shí)間(DC50),DC50≥6小時(shí)表示穩(wěn)定性高,4小時(shí)≤DC506小時(shí)表示穩(wěn)定性處于中等,DC504小時(shí)表示穩(wěn)定性較低。親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:7條候選表位肽(Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274、Rv2629-p315、Rv1736c-p611-1Y和Rv1736c-p576-1Y)的FI值1.5,與HLA-A2分子具有較高的親和力,這7條候選表位肽進(jìn)行后續(xù)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Rv2629-p190-1Y與HLA-A2分子的親和力較高,但穩(wěn)定性低;Rv1736c-p611-1Y和Rv1736c-p576-1Y與HLA-A2分子結(jié)合的親和力和穩(wěn)定性均處于中等水平;Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315與HLA-A2分子有較高的親和力并具有較高的穩(wěn)定性,這四條多肽進(jìn)一步進(jìn)行體外免疫活性檢測。四、M.tb Rv2629蛋白的候選CTL表位多肽的體外免疫活性檢測從健康供者、LTBI者和結(jié)核病患者外周血中分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),用親和力和穩(wěn)定性均較高的4個(gè)候選表位多肽和重組人白介素-2(rh IL-2)對PBMCs進(jìn)行刺激,1次/周,每次刺激后3天進(jìn)行半量換液,同時(shí)留取培養(yǎng)上清,用ELISA方法來檢測分泌IFN-γ的量,刺激3次后用刺激生成的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞,荷肽的T2細(xì)胞作為靶細(xì)胞,用ELISPOT法來檢測分泌IFN-γ的CTL的數(shù)量,用LDH法檢測CTL的特異性殺傷活性。ELISA結(jié)果顯示:隨著刺激次數(shù)的增加,健康供者、LTBI者和結(jié)核病患者的PBMCs培養(yǎng)上清中的IFN-γ分泌量均有不同程度的增加,但是在結(jié)核病患者中IFN-γ分泌量和增加幅度明顯高于其他兩組。ELISPOT結(jié)果顯示:候選表位多肽Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p315和Rv2629-p274刺激結(jié)核病患者組的PBMCs生成分泌IFN-γ的CTL的能力顯著高于健康供者組和LTBI者組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p值0.01。細(xì)胞毒殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:候選表位肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL的殺傷活性隨著效靶比的增加而相應(yīng)的提高,當(dāng)效靶比為100∶1時(shí),Rv2629-p190-2L誘導(dǎo)的CTL對靶細(xì)胞的殺傷性最高,殺傷率可達(dá)到53.91%,Rv2629-p190-1Y2L和Rv2629-p315誘導(dǎo)的CTL對靶細(xì)胞的殺傷效果相近,處于中等水平,殺傷率分別是27.11%和23.91%,而Rv2629-p274誘導(dǎo)的CTL對靶細(xì)胞也有一定的殺傷效果,但殺傷率相對較低,僅為13.75%。經(jīng)過交叉刺激試驗(yàn),Rv2629-p190-2L和Rv2629-p190-1Y2L均能識別其母肽Rv2629-p190,說明改造肽刺激生成的CTL仍可識別其野生型抗原。在效-靶細(xì)胞反應(yīng)體系中加入抗HLA-A2單抗,殺傷活性消失,說明這種特異性殺傷具有HLA-A2限制性,因此Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p315和Rv2629-p274是HLA-A2限制性CTL表位。綜上所述,本研究聯(lián)合應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)和體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)現(xiàn)并鑒定了M.tb Rv2629蛋白的4個(gè)9肽片段:Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315為HLA-A2限制性CTL表位,并發(fā)現(xiàn)其在結(jié)核病患者中具有較高免疫原性,有可能成為結(jié)核病免疫治療及表位疫苗開發(fā)的候選靶標(biāo)。我們將進(jìn)一步開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn),評價(jià)Rv2629蛋白的這4個(gè)CTL表位在治療和預(yù)防結(jié)核病方面的效果,為開發(fā)新型表位疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 Rv2629 Rv1736c 抗原表位 CTL表位 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 英文縮寫14-16
• 前言16-17
• 材料和方法17-27
• 結(jié)果27-34
• 附圖34-38
• 附表38-44
• 討論44-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 綜述 結(jié)核分枝桿菌抗原的HLA-A2限制性CTL表位研究進(jìn)展56-66
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 致謝66-67
• 個(gè)人簡歷67

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李江英;白雪娟;梁艷;張俊仙;陽幼榮;趙衛(wèi)國;吳雪瓊;;用DNAStar軟件預(yù)測Rv1410c結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原表位[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年04期

2 董毅;吳利先;;T細(xì)胞免疫在抗結(jié)核桿菌感染中的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年18期

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白Rv2629及Rv1736c的HLA-A2限制性CTL表位的預(yù)測與鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：300065