大腸桿菌（Escherichia coli,E.coli）O157:H7面臨不良環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)進(jìn)入活的不可培養(yǎng)（viable but nonculturable state,VBNC）狀態(tài),無法在常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖,從而造成食源性致病菌的漏檢,給人類健康造成嚴(yán)重威脅。因此,本課題選取E.coli O157:H7作為研究對(duì)象,通過敲除基因技術(shù)獲得突變株,研究野生株和基因缺陷株進(jìn)入VBNC狀態(tài)的差異,及基因缺失導(dǎo)致E.coli O157:H7的生物學(xué)特性的改變。研究?jī)?nèi)容包括三個(gè)部分:用Red兩步同源重組的方法構(gòu)建E.coli O157:H7的基因缺陷株,富營養(yǎng)低溫誘導(dǎo)E.coli O157:H7基因缺陷株進(jìn)入VBNC狀態(tài),以及探究E.coli O157:H7基因缺陷株的生物學(xué)特性。本課題敲除方案:選取可能對(duì)E.coli O157:H7 VBNC形成的三個(gè)關(guān)鍵基因fimC、luxS和rpoS,運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出其兩翼與打靶基因上下游同源,中間為卡那霉素抗性基因的DNA片段。通過電轉(zhuǎn)化的方法,將外源DNA片段轉(zhuǎn)入預(yù)先導(dǎo)入質(zhì)粒pKD46的E.coli O157:H7中。誘導(dǎo)Red重組酶的表達(dá),... 

【文章來源】：武漢工程大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1兩步同源重組的原理

6圖 1-2 兩步同源重組的質(zhì)粒圖譜a：質(zhì)粒 pKD46 圖譜；b：質(zhì)粒 pCP20 圖譜；C：質(zhì)粒 pKD4 圖譜Figure 1-2 Plasmid map of two-step Red-mediated recombinationa: plasmid map of pKD46; b: plasmid map of pCP20; C: plasmid map of pKD4轉(zhuǎn)錄融合的 lacZ 突變株，發(fā)現(xiàn)突變株對(duì)各自的調(diào)控基因都表現(xiàn)出差異，此外，他們還發(fā)現(xiàn)鑒于 FLP 重組酶不要求宿主有特異功能，不需要分子克隆，Red 重組系統(tǒng)適用于分析多種生物的基因表達(dá)。Zhang等[14]通過兩步正負(fù)篩選法優(yōu)化了同源重組的過程，在第一步同源重組時(shí)將正負(fù)篩選標(biāo)記插入基因組的特定位置，使用正篩選標(biāo)記篩選重組

為了去除引入的選擇性標(biāo)記基因——陽性和陰性選擇標(biāo)記基因（sacB），通過將培養(yǎng)基改為鼠李糖來誘導(dǎo) pREDI 編碼的 I-SceI 核酸內(nèi)在整合的 DNA 片段上存在的 I-SceI 核酸內(nèi)切酶割，誘導(dǎo) DSB 修復(fù)功能。DSB 介導(dǎo)的兩個(gè)同組導(dǎo)致插入的缺失盒的去除，產(chǎn)生無標(biāo)記的基

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]高壓二氧化碳誘導(dǎo)Escherichia coli O157:H7形成活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的機(jī)制研究[D]. 趙鳳.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014

碩士論文
[1]兩種食源性致病菌VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)與分子檢測(cè)技術(shù)研究[D]. 田聰.華南理工大學(xué) 2013



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