本文關(guān)鍵詞：兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】本試驗(yàn)通過在體外添加不同生長(zhǎng)因子,擬探索穩(wěn)定高效的體外誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為胰島β細(xì)胞的誘導(dǎo)體系,為進(jìn)一步進(jìn)行深入研究及臨床實(shí)踐中應(yīng)用干細(xì)胞移植治療糖尿病奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)及臨床指導(dǎo)意義�！痉椒ā糠謩e采用全骨髓貼壁法和紅細(xì)胞裂解法體外分離獲取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs),倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活性、記錄兩種分離方法首次達(dá)到傳代的時(shí)間、細(xì)胞免疫組化法鑒定CD90、CD44、CD34表面抗原的表達(dá);分別在原代培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)首次換液,以后每3 d換液一次,記錄各組各代培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)總周期,篩選出最佳首次換液時(shí)間;取生長(zhǎng)良好的P3代細(xì)胞,采用添加體外生長(zhǎng)因子三步法,分階段將兔BMSCs體外誘導(dǎo)為胰島細(xì)胞,第一階段用含有10ng/mLbFGF、1%DMSO、1%FBS、23 mmol/LGlucose的H-DMEM培養(yǎng)液對(duì)BMSCs誘導(dǎo)3d,第二階段用含有10 ng/mLbFGF、10 ng/mLEGF、2%B27、10 mmol/L尼克酰胺、17.5mmol/LGlucose的無血清DMEM/F-12培養(yǎng)液對(duì)BMSCs誘導(dǎo)8 d,第三階段用含有10mmol/LHEPES、10 mmol/L尼克酰胺,2 nmol/L的activin-A,11.1 mmol/LGlucose的RPMI1640培養(yǎng)液對(duì)兔BMSCs誘導(dǎo)8 d,倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化;雙硫腙染色鑒定細(xì)胞團(tuán);胰島細(xì)胞特異性基因(Pdx-1、Insulin、Nkx6.1)的表達(dá)用RT-PCR方法檢測(cè);免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)特異性蛋白(胰島素蛋白)的表達(dá);ELISA檢測(cè)胰島素分泌的情況�！窘Y(jié)果】?jī)煞N分離方法均能獲得較均一的長(zhǎng)梭形細(xì)胞,所培養(yǎng)細(xì)胞CD90、CD44抗原陽性表達(dá),CD34抗原陰性表達(dá)。其中紅細(xì)胞裂解法所得細(xì)胞活性較全骨髓貼壁法高,首次傳代時(shí)間短,差異顯著(P0.05);24h首次換液各代達(dá)傳代時(shí)間所需時(shí)間與其他各組比較差異極顯著(P0.01),為最佳首次換液時(shí)間,可顯著縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期;第一階段誘導(dǎo)末(3 d),細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,部分細(xì)胞變圓,雙硫腙染色不著色,RT-PCR未檢測(cè)到任何特異性基因的表達(dá);誘導(dǎo)第7 d時(shí),細(xì)胞逐漸融合,細(xì)胞簇增多,直徑變大,雙硫腙染色細(xì)胞團(tuán)呈棕紅色,僅檢測(cè)到PDX-1基因的表達(dá),證實(shí)其為胰島前體細(xì)胞;第二階段誘導(dǎo)末(11 d),細(xì)胞簇?cái)?shù)目增多,細(xì)胞邊緣突起,檢測(cè)到PDX-1、Insulin的表達(dá);第三階段誘導(dǎo)末,細(xì)胞團(tuán)狀物與周圍組織分離,形成類胰島樣結(jié)構(gòu),雙硫腙染色細(xì)胞呈紅棕色,PDX-1、Insulin、Nkx6.1基因均表達(dá);免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胰島素蛋白的表達(dá),試驗(yàn)組細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量棕黃色顆粒,結(jié)果呈陽性反應(yīng),對(duì)照組細(xì)胞胞漿內(nèi)未出現(xiàn)棕黃色顆粒,結(jié)果呈陰性反應(yīng);誘導(dǎo)3、7、11、15、19 d的胰島素分泌量分別為(27.86±0.034μIU/mL)、(29.33±0.48μIU/mL)、(29.92±0.46μIU/mL)、(31.32±0.03μIU/mL),與對(duì)照組(20.54±0.21μIU/mL)、(22.10±0.45μIU/mL)、(22.36±0.35μIU/mL)、(23.39±0.20μIU/mL),3 d時(shí)誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比差異不顯著,因?yàn)榇藭r(shí)未出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)樣變化,未分泌胰島素,7 d、11 d、19 d差異均顯著(P0.05)�！窘Y(jié)論】采用紅細(xì)胞裂解液法,24h首次換液能夠明顯縮短骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)周期,所得細(xì)胞生長(zhǎng)增值能力強(qiáng)、純度高、生物學(xué)特性穩(wěn)定,具有多向分化能力;在體外采用生長(zhǎng)因子三階段誘導(dǎo)法,能夠誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成熟的具有功能性的胰島β細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 紅細(xì)胞裂解液法 全骨髓貼壁法 生長(zhǎng)因子 胰島β細(xì)胞 誘導(dǎo)分化 兔
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 致謝5-9
• 摘要9-11
• 文獻(xiàn)綜述11-18
• 1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展12-15
• 1.1 BMSCs的發(fā)現(xiàn)和分布12
• 1.2 BMSCs的生物學(xué)特性12-13
• 1.3 BMSCs的分離方法13
• 1.4 BMSCs定向分化的機(jī)制13-14
• 1.5 BMSCs的應(yīng)用前景14-15
• 2 BMSCs向胰島細(xì)胞分化的研究進(jìn)展15-18
• 2.1 BMSCs向胰島細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化方法的研究15-17
• 2.1.1 誘導(dǎo)劑法15-16
• 2.1.2 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控法16-17
• 2.1.3 共培養(yǎng)法17
• 2.2 BMSCs胰島樣分化在臨床上的應(yīng)用17-18
• 試驗(yàn)一 不同分離方法及首次換液時(shí)間對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響18-27
• 引言18
• 1 材料與方法18-21
• 1.1 試驗(yàn)材料18-19
• 1.1.2 主要試劑18
• 1.1.3 主要儀器與器材18-19
• 1.2 試劑的配制19-20
• 1.2.1 PBS緩沖液配制19
• 1.2.2 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液19
• 1.2.3 雙抗配制19
• 1.2.4 FBS的凍融19
• 1.2.5 DMEM/F-12完全培養(yǎng)基19
• 1.2.6 臺(tái)盼藍(lán)染色液19-20
• 1.3 試驗(yàn)方法20-21
• 1.3.1 BMSCs的提取20
• 1.3.2 全骨髓貼壁法20
• 1.3.3 紅細(xì)胞裂解法20
• 1.3.4 兔BMSCs細(xì)胞活性檢測(cè)20
• 1.3.5 兔BMSCs生長(zhǎng)曲線的繪制20-21
• 1.3.6 首次換液時(shí)間對(duì)兔BMSCs的影響21
• 1.3.7 細(xì)胞免疫組化鑒定兔BMSCs21
• 1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理21
• 2 結(jié)果與分析21-24
• 2.1 不同分離方法對(duì)兔BMSCs形態(tài)和生長(zhǎng)的影響21-23
• 2.2 兔BMSCs生長(zhǎng)曲線繪制23-24
• 2.3 兔BMSCs的鑒定24
• 2.4 首次換液時(shí)間對(duì)兔BMSCs培養(yǎng)周期的影響24
• 3 討論24-26
• 4 小結(jié)26-27
• 試驗(yàn)二 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化的研究27-39
• 引言27
• 1 材料27-29
• 1.1 試驗(yàn)材料27-28
• 1.1.1 試驗(yàn)對(duì)象27
• 1.1.2 主要試劑27-28
• 1.1.3 主要儀器與器械28
• 1.2 主要試劑配制28-29
• 1.2.1 生長(zhǎng)因子（bFGF，EGF，activin-A，HGF）配制為 1μg/mL28
• 1.2.2 配制 1mol/L HEPES28
• 1.2.3 不同濃度（0.23mol/L，0.175mol/L，0.111 mol/L）葡萄糖的配制28-29
• 1.2.4 第一階段的誘導(dǎo)劑29
• 1.2.5 第二階段的誘導(dǎo)劑29
• 1.2.6 第三階段的誘導(dǎo)劑29
• 1.2.7 雙硫腙染色劑29
• 1.2.8 0.2％TritonX-10029
• 1.2.9 DAB顯色液29
• 2 試驗(yàn)方法29-33
• 2.1 體外定向誘導(dǎo)分化29-30
• 2.2 雙硫腙染色30
• 2.3 RT-PCR檢測(cè)胰島細(xì)胞特異性基因的表達(dá)30-32
• 2.3.1 細(xì)胞總RNA的提取30-31
• 2.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成c DNA31
• 2.3.3 PCR反應(yīng)31-32
• 2.3.4 瓊脂糖凝膠電泳32
• 2.4 免疫組織化學(xué)染色32
• 2.5 ELISA檢測(cè)32-33
• 2.6 數(shù)據(jù)處理33
• 3 結(jié)果與分析33-37
• 3.1 誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化33-34
• 3.2 DTZ染色鑒定結(jié)果34
• 3.3 RT-PCR檢測(cè)胰島細(xì)胞特異性基因表達(dá)34-35
• 3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果35-36
• 3.5 ELISA檢測(cè)結(jié)果36-37
• 4 討論37-38
• 5 小結(jié)38-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-49
• 英文縮寫詞表49-50
• ABSTACT50-51

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