目的體外表達金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）凝固酶Coa,評價其生物學(xué)活性。方法根據(jù)GenBank中金黃色葡萄球菌凝固酶coa基因序列設(shè)計特異性引物,采用PCR方法從S.aureus USA300 CA-MRSA 923株基因組中擴增coa基因片段,將其克隆至pET-24b（+）表達載體,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-24b-coa;將經(jīng)雙酶切及測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli BL21（DE3）中進行IPTG誘導(dǎo)表達;通過SDS-PAGE和Western blot對表達的重組Coa（rCoa）進行鑒定,測定rCoa對人血液和兔血漿的凝固活性;最后用純化的重組蛋白rCoa免疫BALB/c小鼠,經(jīng)間接ELISA和Western blot分析其免疫原性。結(jié)果構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-24b-coa在E.coli BL21（DE3）中以包涵體形式表達rCoa,分子量約74.8 ku,與預(yù)期蛋白大小相符;rCoa在體外具有凝固人全血和兔血漿活性,能刺激小鼠產(chǎn)生高效價的抗Coa特異性抗體。結(jié)論成功地獲得了具有良好凝固酶活性和抗原性的金黃色葡萄球... 

【文章來源】：中國人獸共患病學(xué)報. 2020年09期 北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

coa基因的PCR擴增

coa基因的PCR擴增及重組質(zhì)粒pET-24b-coa的酶切鑒定

表達菌E.coli BL21(DE3)經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)1、2、3、4、6 h 進行SDS-PAGE分析,在誘導(dǎo)1 h時,rCoa蛋白開始表達,在相對分子質(zhì)量約為74.8 ku 處有明顯的蛋白質(zhì)表達條帶,與目的蛋白基本一致,但表達量較低。當(dāng)誘導(dǎo)4 h和6 h時rCoa蛋白表達量差不多,達到最高,因此在蛋白表達時選擇誘導(dǎo)時間為4 h。陰性對照含空載體pET-24b(+)的工程菌和未誘導(dǎo)對照菌中未見有目的蛋白表達(圖3)。2.3 重組蛋白的表達形式

【參考文獻】：
期刊論文
[1]金黃色葡萄球菌血漿凝固酶克隆、表達、純化及其生物活性研究[J]. 張葉影,崔海亮,楊靜,葛新,王越,屈野.  武警后勤學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2017(12)



本文編號：2950865