本文關(guān)鍵詞：遲緩愛德華氏菌藍(lán)藻口服疫苗的構(gòu)建和免疫評價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種危害性極大的致病菌,對我國魚類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,國外有該菌的注射疫苗,但接種極不方便,市場急需該菌的口服疫苗。本課題旨在開發(fā)用藍(lán)藻作為宿主的與注射疫苗相比能大大節(jié)省人力財(cái)力的口服疫苗,并對該口服疫苗進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的評價(jià)。方法：本課題首先提取遲緩愛德華氏菌基因組DNA,用PCR技術(shù)分別將遲緩愛德華氏菌的兩個(gè)免疫原性較好的蛋白基因Etal和GAPDH擴(kuò)增,并通過重疊PCR將其融合,構(gòu)建中間載體后再與可在大腸桿菌和藍(lán)藻中穿梭表達(dá)的載體pRL489連接,之后將含有目的基因和該表達(dá)載體的大腸桿菌與含有接合質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的大腸桿菌混合,以三親接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化魚腥藻PCC7120 (Anabaena sp. PCC7120),用新霉素抗性篩選出轉(zhuǎn)基因藻,利用PCR結(jié)果測序,：RT-PCR驗(yàn)證該轉(zhuǎn)基因藻,并用Western-blot方法檢測融合基因的表達(dá)；本課題同時(shí)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增融合后的基因,并將其先與中間載體連接驗(yàn)證正確后再與pET-30a表達(dá)載體連接,在BL21(DE3)菌中大量表達(dá)融合蛋白并用SDS-PAGE和Western-blot方法檢測融合蛋白的表達(dá)。通過鎳柱親和層析和葡聚糖凝膠Sephadex G-100將其純化。由于其攜帶有組氨酸標(biāo)簽,可被組氨酸抗體檢測到,因此可以將其用做蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。通過Western-blot實(shí)驗(yàn)后條帶灰度值的比較測定藍(lán)藻中融合蛋白的表達(dá)量。本課題最后通過反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因藻,離心收集藻細(xì)胞凍干。將年幼斑馬魚隨機(jī)分成7組,每組25尾。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分別喂食野生魚腥藻7120,含pRL489空載體魚腥藻7120,含融合基因轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120。其中喂食含融合基因轉(zhuǎn)基因藻又細(xì)分為高中低三個(gè)劑量組。再用致病性遲緩愛德華氏菌EIB202攻毒或用PBS假攻毒后記錄魚的存活情況,繪制各組魚的死亡曲線以此評價(jià)疫苗免疫效果。結(jié)果：本課題成功構(gòu)建在魚腥藻PCC7120中表達(dá)的載體pRL-489-etal-L-gapdh,并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌和魚腥藻PCC7120,并在大腸桿菌和藍(lán)藻中均檢測到融合蛋白的表達(dá),然而表達(dá)的產(chǎn)物分子量與預(yù)期大小不一致,比預(yù)期大小偏小,然而在這兩個(gè)體系中表達(dá)的融合蛋白其分子量是一致的；同時(shí)本課題構(gòu)建pET-30a表達(dá)載體上融合基因檢測到了大量表達(dá),分子量大小與預(yù)期一致；又進(jìn)一步將其純化,并據(jù)此計(jì)算出融合蛋白在轉(zhuǎn)基因藻中的表達(dá)量為2.46%左右。本課題最后評價(jià)轉(zhuǎn)基因藻的免疫保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因魚腥藻并不能對受試斑馬魚產(chǎn)生保護(hù)作用。結(jié)論及意義：本課題成功構(gòu)建了在藍(lán)藻和大腸桿菌中表達(dá)的兩個(gè)表達(dá)載體,并成功檢測到目的基因在大腸桿菌中和藍(lán)藻中獲得表達(dá)。本課題為口服形式的魚用遲緩愛德華氏菌疫苗的開發(fā)提供了很好的思路。首先,課題選用藍(lán)藻作為口服疫苗的載體,既能利用藍(lán)藻的細(xì)胞壁保護(hù)口服疫苗在到達(dá)魚消化道前不被破壞,又可以將疫苗作為魚的天然飼料飼喂需要免疫的魚苗；其次,課題中采用將多個(gè)免疫原性基因融合并表達(dá)融合蛋白的方式,可以作為疫苗開發(fā)的一個(gè)思路。另外本課題構(gòu)建的pET系統(tǒng)表達(dá)融合基因效果非常好,可以考慮將其表達(dá)的融合蛋白純化并開發(fā)成疫苗。
【關(guān)鍵詞】：遲緩愛德華氏菌 口服免疫 融合蛋白 魚腥藻PCC7120 魚用疫苗
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 符號說明11-12
• 第1章 文獻(xiàn)綜述12-23
• 1.1 魚用疫苗類型12
• 1.2 魚用疫苗接種方式12-13
• 1.3 魚病害遲緩愛德華氏菌疫苗的研究進(jìn)展13-17
• 1.3.1 滅活疫苗14
• 1.3.2 弱毒疫苗14-15
• 1.3.3 DNA疫苗15-16
• 1.3.4 亞單位疫苗16
• 1.3.5 空殼疫苗16-17
• 1.3.6 外膜小泡疫苗17
• 1.4 藍(lán)藻作為口服疫苗載體的可行性17-18
• 參考文獻(xiàn)18-23
• 前言23-25
• 第2章 材料與方法25-69
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-29
• 2.1.1 菌種,藻種25
• 2.1.2 質(zhì)粒載體25
• 2.1.3 工具酶25-26
• 2.1.4 核酸蛋白分子Marker及Loading buffer26-27
• 2.1.5 試劑27
• 2.1.6 魚27-28
• 2.1.7 儀器28-29
• 2.1.8 試劑盒29
• 2.1.9 抗體29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-69
• 2.2.1 常用試劑溶液的配制29-33
• 2.2.2 常用實(shí)驗(yàn)方法33-39
• 2.2.3 遲緩愛德華氏菌HtD基因組DNA的提取39
• 2.2.4 PCR擴(kuò)增遲緩愛德華氏菌免疫原性蛋白基因etal及gapdh39-41
• 2.2.5 重疊PCR擴(kuò)增融合基因(etal-L-gapdh)41-43
• 2.2.6 融合基因(etal-L-gapdh)與克隆載體的連接及驗(yàn)證43-44
• 2.2.7 融合基因(etal-L-gapdh)與表達(dá)載體的連接及驗(yàn)證44-48
• 2.2.8 表達(dá)載體pRL489-etal-L-gapdh轉(zhuǎn)化魚腥藻712048-50
• 2.2.9 PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因魚腥藻712050-52
• 2.2.10 轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻穩(wěn)定性考察52-54
• 2.2.11 轉(zhuǎn)基因藻中融合基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析54-57
• 2.2.12 大腸桿菌中融合基因蛋白表達(dá)分析57-58
• 2.2.13 轉(zhuǎn)基因藻中融合基因蛋白表達(dá)分析58-59
• 2.2.14 用于pET體系的表達(dá)載體構(gòu)建59-62
• 2.2.15 融合基因在pET-30a體系中的表達(dá)驗(yàn)證62-64
• 2.2.16 融合蛋白的分離純化64-65
• 2.2.17 轉(zhuǎn)基因藻中融合蛋白表達(dá)量的確定65-66
• 2.2.18 轉(zhuǎn)基因藻免疫斑馬魚實(shí)驗(yàn)66-69
• 第3章 結(jié)果與討論69-98
• 3.1 遲緩愛德華氏菌HtD基因組DNA69
• 3.2 免疫原性蛋白基因etal及gapdh的PCR擴(kuò)增69-70
• 3.3 重疊PCR擴(kuò)增融合基因70-71
• 3.4 融合基因(etal-L-gapdh)與克隆載體的連接及驗(yàn)證71-75
• 3.5 融合基因與表達(dá)載體的連接及驗(yàn)證75-78
• 3.6 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化魚腥藻712078-79
• 3.7 抗生素篩選轉(zhuǎn)基因魚腥藻712079
• 3.8 PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因魚腥藻712079-81
• 3.9 轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻穩(wěn)定性考察81-82
• 3.10 轉(zhuǎn)基因藻中融合基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析82-84
• 3.11 大腸桿菌中融合基因蛋白表達(dá)分析84-85
• 3.12 轉(zhuǎn)基因藻中融合基因蛋白表達(dá)分析85-88
• 3.13 用于pET體系的表達(dá)載體構(gòu)建88-90
• 3.14 融合基因在pET-30a體系中的表達(dá)驗(yàn)證90-91
• 3.15 融合蛋白的分離純化91-92
• 3.16 Western-blot驗(yàn)證不同宿主中融合蛋白表達(dá)92-93
• 3.17 轉(zhuǎn)基因藻中融合蛋白表達(dá)量的確定93-95
• 3.18 轉(zhuǎn)基因藻免疫斑馬魚實(shí)驗(yàn)95-98
• 第4章 結(jié)語98-101
• 參考文獻(xiàn)101-104
• 致謝104-105
• 在學(xué)期間主要研究成果105

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陸亢興;愛德華氏菌致肝膿腫[J];臨床檢驗(yàn)雜志;1990年03期

2 余露軍;李寧求;劉禮輝;付小哲;石存斌;潘厚軍;吳淑勤;;日本鰻鱺混合感染遲緩愛德華氏菌與創(chuàng)傷弧菌的分離與鑒定[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2009年08期

3 高大慶,黃錫全,闞飆,陸承平,劉延清,吳守一;遲緩愛德華氏菌新的溶血活化基因功能的研究[J];中國人獸共患病雜志;2001年06期

4 吳斌;;抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體制備及初步鑒定[J];福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年01期

5 龔艷清;郭書林;陳信忠;楊俊萍;葉妍妍;;MALDI-TOF-MS在愛德華氏菌檢測中的應(yīng)用[J];中國動(dòng)物檢疫;2014年06期

6 馬勛,歐陽志明,陳懷青,陸承平,夏曉勤;遲緩愛德華氏菌對HEp-2細(xì)胞的侵襲特性[J];微生物學(xué)報(bào);1998年05期

7 曹溫年，常承忠，李元?jiǎng)P，，邱海燕;在羊的血培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)一株與布魯氏菌交叉反應(yīng)的遲緩愛德華氏菌[J];中國人獸共患病雜志;1994年06期

8 潘鴻洧;石存斌;趙毅;劉坡;吳淑勤;;鰻鱺遲緩愛德華氏菌偶聯(lián)疫苗免疫效果評價(jià)[J];免疫學(xué)雜志;2010年02期

9 陳宗淦,朱江,魏威,吳瑩芳;遲緩愛德華氏菌敗血癥3例[J];大理醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1998年03期

10 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 潘鴻洧;吳淑勤;石存斌;;愛德華氏菌亞單位疫苗的制備與純化[A];2007年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會暨水產(chǎn)微生態(tài)調(diào)控技術(shù)論壇論文摘要匯編[C];2007年

2 謝國駟;黃P";;遲緩愛德華氏菌熒光定量PCR檢測方法的建立和應(yīng)用[A];2010年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

3 高志鵬;謝海俠;聶品;劉家壽;;遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)Ⅲ型分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的自凝集和生物膜形成研究[A];中國水產(chǎn)學(xué)會魚病專業(yè)委員會2013年學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2013年

4 胡宏曉;呂愛軍;;鯽魚鰓中洶愛德華氏菌和維羅納假單胞菌的分離與鑒定[A];2012年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2012年

5 雷燕;戚瑞榮;唐紹林;李云冰;藍(lán)雅玲;張會軍;馬家好;;人工養(yǎng)殖長吻洜(Leiocassis longirostris)洶愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[A];中國水產(chǎn)學(xué)會魚病專業(yè)委員會2013年學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2013年

6 李杰;莫照蘭;李貴陽;肖鵬;;遲緩愛德華氏菌弱毒株的構(gòu)建及其免疫效果[A];中國水產(chǎn)學(xué)會魚病專業(yè)委員會2013年學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2013年

7 李華;魏暢;葉仕根;李強(qiáng);;洶愛德華氏菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)hcp基因的克隆及重組表達(dá)[A];中國水產(chǎn)學(xué)會魚病專業(yè)委員會2013年學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2013年

8 孔繁德;陳瓊;王生育;黃印堯;陳信忠;龔艷清;;福建家養(yǎng)淡水魚暴發(fā)傳染病的細(xì)菌分離鑒定與防治[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2004學(xué)術(shù)年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2004年

9 隗黎麗;周秋白;熊六鳳;王自蕊;楊竹青;劉毅;;江西地區(qū)黃顙魚洶愛德華氏菌的分離鑒定及PCR檢測方法的建立[A];中國水產(chǎn)學(xué)會魚病專業(yè)委員會2013年學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2013年

10 朱凝瑜;孔蕾;貝亦江;丁雪燕;鄭天倫;陳健舜;;中華鱉遲緩愛德華氏菌的分離鑒定與致病性研究[A];中國水產(chǎn)學(xué)會魚病專業(yè)委員會2013年學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2013年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院;大菱鲆遲緩愛德華氏菌抗體快速檢測試紙條[N];中國漁業(yè)報(bào);2013年

2 雷燕 戚瑞榮;愛德華氏菌、氣單胞菌和虹彩病毒混合感染引起冬棚養(yǎng)殖點(diǎn)籃子魚死亡[N];中國漁業(yè)報(bào);2014年

3 吳桂亮;魚肝膽綜合征要綜合防治[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2007年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 李墨非;海水魚類病原菌遲緩愛德華氏菌和海豚鏈球菌的致病機(jī)制[D];中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所);2015年

2 王斌;遲緩愛德華氏菌易感細(xì)胞模型的建立及病原菌—宿主細(xì)胞互作研究[D];中國海洋大學(xué);2013年

3 孫云;遲緩愛德華氏菌高效疫苗的設(shè)計(jì)、構(gòu)建以及免疫機(jī)制研究[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2013年

4 李杰;遲緩愛德華氏菌弱毒疫苗的研制和免疫效果[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2012年

5 王燕;兩株海洋病原菌的分離鑒定、致病機(jī)理研究及三株海洋新菌的分類鑒定[D];中國海洋大學(xué);2010年

6 焦緒棟;遲緩愛德華氏菌基因工程疫苗的構(gòu)建及免疫效果的研究[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2010年

7 王正麗;免疫增強(qiáng)劑對牙鲆（Paralichthys Olivaceu）免疫力和抗病力的影響[D];中國海洋大學(xué);2004年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫何軍;牙鲆家系的建立與抗遲緩愛德華氏菌病家系的篩選與分析[D];上海海洋大學(xué);2015年

2 陽磊;洶愛德華氏菌和魯氏耶爾森氏菌二聯(lián)口服疫苗制備及免疫效果評價(jià)[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 潘延樂;洶愛德華氏菌ompN基因的克隆及其原核表達(dá)產(chǎn)物對斑點(diǎn)叉尾洶的保護(hù)效果評價(jià)[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 郭欣;南方鲇愛德華氏菌的分離鑒定及雙重PCR診斷方法的建立[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 孫苗苗;吲哚在遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究[D];中國海洋大學(xué);2015年

6 王智;遲緩愛德華氏菌藍(lán)藻口服疫苗的構(gòu)建和免疫評價(jià)[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

7 邵帥;愛德華氏菌基因組測序及進(jìn)化分析[D];華東理工大學(xué);2014年

8 張曉佩;遲緩愛德華氏菌鞭毛蛋白的研究[D];福建師范大學(xué);2008年

9 蘭建新;養(yǎng)殖大菱鲆病原菌遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及快速檢測技術(shù)的建立[D];中國海洋大學(xué);2008年

10 王榮華;洶愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）菌蛻疫苗的研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：遲緩愛德華氏菌藍(lán)藻口服疫苗的構(gòu)建和免疫評價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：294188