目的采用超速離心法（UC）和優(yōu)化后的排阻超濾組合法提取肝星狀細胞（HSC）來源外泌體,比較兩種提取方法所得外泌體的純度、濃度和總蛋白量。方法分別用UC法和優(yōu)化后的排阻超濾組合法提取HSC來源外泌體。使用透射電鏡觀察外泌體形態(tài),納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA）檢測外泌體濃度及大小,二喹啉甲酸（BCA）試劑盒檢測外泌體總蛋白濃度,Western blotting法檢測外泌體表面標志物腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、分化抗原9（CD9）的表達。結(jié)果兩種方法均可得到圓盤形的30～150 nm膜性囊泡。優(yōu)化后的排阻超濾組合法所得外泌體,在電鏡下可見明顯的"茶托"形結(jié)構(gòu),背景較干凈,純度較高。UC法和優(yōu)化后的排阻超濾組合法所得外泌體濃度分別為2×10⁹、3.6×10¹¹ particles/ml,平均粒徑分別為112.6、121.7 nm。優(yōu)化后的排阻超濾組合法所得外泌體總蛋白濃度及TSG101的表達高于UC法。結(jié)論優(yōu)化后的排阻超濾組合法雖然操作繁瑣,成本較高,但提取的HSC來源外泌體濃度、總蛋白濃度和純度較超速離心法高,可以作為外泌體分離的有效方... 

【文章來源】：臨床和實驗醫(yī)學雜志. 2020年07期

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

各組GM130、TSG101和CD9蛋白的表達注

細胞培養(yǎng)上清0.22 μm過濾后,向100 kd超濾管中加入已濾的上清,4 000 g(離心半徑6.5 cm)離心10 min后收集液體。凝膠排阻柱經(jīng)60 ml PBS沖洗進行柱平衡備用。將預(yù)處理好的培養(yǎng)上清加入排阻柱中。再將收集管置于排阻柱下方,在排阻柱中添加PBS進行洗脫并收集洗脫液。將收集到的外泌體全部倒入100 kd超濾管,4 000 g(離心半徑6.5 cm)離心15 min,至剩余液體在200 μl左右即為濃縮后的外泌體,保存至-80℃。見圖1。1.3 外泌體形態(tài)觀察

透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),兩種方法所得的外泌體大小均在100 nm左右,具有明顯的膜結(jié)構(gòu),呈圓盤形。與UC法相比,優(yōu)化后的排阻超濾組合法所得外泌體在電鏡下可見明顯的“茶托”形結(jié)構(gòu),純度較高。見圖2。2.2 外泌體粒徑及濃度比較


本文編號：2933001