禽流感大爆發(fā)嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)和人類健康,并給社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而接種禽流感疫苗是目前主要的預(yù)防措施。無血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)因其易于放大、工藝穩(wěn)定、過程可控等優(yōu)勢,正成為流感疫苗生產(chǎn)的主流技術(shù)。面對禽流感疫苗市場供不應(yīng)求的現(xiàn)狀,如何應(yīng)用無血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)提高禽流感病毒產(chǎn)量的研究工作尤為重要。其中,無血清培養(yǎng)基是影響流感病毒生產(chǎn)最關(guān)鍵的因素之一。但當(dāng)下無血清培養(yǎng)基多依賴國外進(jìn)口,其價格昂貴、配方保密、不利于過程優(yōu)化。此外,病毒生產(chǎn)特性不同于細(xì)胞生長,而在研究或工業(yè)生產(chǎn)中,病毒生產(chǎn)階段所用維持培養(yǎng)基大多與細(xì)胞生長培養(yǎng)基是同一種,這種營養(yǎng)組分的不平衡限制了流感病毒的高效擴(kuò)增。因此,迫切需要針對病毒生產(chǎn)階段開發(fā)適于流感病毒生產(chǎn)的維持培養(yǎng)基。本文以MDCK細(xì)胞和H9N2禽流感病毒為研究對象,首先基于現(xiàn)有的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝,連續(xù)運用Simplex Lattice、Placektt-Burman和中心組合實驗設(shè)計三種統(tǒng)計學(xué)方法,開發(fā)了一種支持H9N2流感病毒在MDCK懸浮細(xì)胞中高效擴(kuò)增的Opt-MM培養(yǎng)基。接著,在搖瓶體系中對稀釋接毒工藝進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后最優(yōu)稀釋比例為1:1;在2L生物... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 禽流感及禽流感疫苗
        1.1.1 禽流感
        1.1.2 禽流感病毒
        1.1.3 禽流感疫苗
    1.2 禽流感疫苗動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝
        1.2.1 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展
        1.2.2 MDCK細(xì)胞及其生產(chǎn)流感疫苗的方式
        1.2.3 MDCK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究進(jìn)展
    1.3 流感病毒維持培養(yǎng)基的開發(fā)
        1.3.1 細(xì)胞生長培養(yǎng)基與維持培養(yǎng)基
        1.3.2 影響流感病毒生產(chǎn)的重要添加物
        1.3.3 無血清培養(yǎng)基的開發(fā)方法
    1.4 本文的研究內(nèi)容、目的及意義
第2章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細(xì)胞株
        2.1.2 流感病毒株
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 實驗材料及儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 貼壁MDCK細(xì)胞復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)
        2.2.2 懸浮MDCK細(xì)胞復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)
        2.2.3 病毒感染
    2.3 分析方法
        2.3.1 細(xì)胞計數(shù)
        2.3.2 流感病毒HA滴度的測定
50的測定">        2.3.3 流感病毒TCID₅₀的測定
        2.3.4 細(xì)胞代謝物濃度的測定
    2.4 數(shù)據(jù)處理
        2.4.1 細(xì)胞比生長速率的計算
        2.4.2 MOI的計算
        2.4.3 單細(xì)胞產(chǎn)毒率的計算
        2.4.4 代謝物比消耗或比生成速率的計算
        2.4.5 統(tǒng)計學(xué)分析
第3章 維持培養(yǎng)基的開發(fā)與優(yōu)化
    3.1 前言
    3.2 實驗方案
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 Simplex Lattice實驗設(shè)計篩選維持培養(yǎng)基基本組成
        3.3.2 Placektt-Burman實驗設(shè)計篩選促進(jìn)流感病毒生產(chǎn)的顯著添加物
        3.3.3 中心組合設(shè)計優(yōu)化促進(jìn)病毒生產(chǎn)的顯著添加物濃度
    3.4 本章小結(jié)
第4章 維持培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中的驗證及細(xì)胞代謝研究
    4.1 引言
    4.2 實驗方案
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 接毒稀釋流加工藝優(yōu)化
        4.3.2 2L生物反應(yīng)器驗證
        4.3.3 細(xì)胞代謝特性研究
    4.4 本章小結(jié)
第5章 維持培養(yǎng)基的應(yīng)用初探
    5.1 前言
    5.2 實驗方案
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 維持培養(yǎng)基在不同種類胰酶條件下的應(yīng)用
        5.3.2 維持培養(yǎng)基在不同種類毒株條件下的應(yīng)用
        5.3.3 維持培養(yǎng)基在MDCK細(xì)胞傳代方面的應(yīng)用
    5.4 本章小結(jié)
第6章 全文總結(jié)與展望
    6.1 全文總結(jié)
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間撰寫的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[4]禽流感疫苗研究進(jìn)展[J]. 周虹妤,裴磊,馮嘉林,盛瑜.  中國畜牧獸醫(yī)文摘. 2016(08)
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[10]低濃度金屬離子體外抗病毒研究[J]. 侯欣彤,徐斌斌,劉艷,田曉樂,張益波,孟慶繁.  食品工業(yè)科技. 2007(06)

博士論文
[1]基于MDCK細(xì)胞高密度培養(yǎng)的甲型流感病毒疫苗生產(chǎn)工藝開發(fā)與優(yōu)化[D]. 黃錠.華東理工大學(xué) 2016

碩士論文
[1]無血清懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生產(chǎn)H9亞型禽流感疫苗的關(guān)鍵控制點探究[D]. 彭雯娟.華東理工大學(xué) 2017



本文編號：2902142