目的通過構(gòu)建雙基因編輯小鼠模型（α7R-/-/gp120+）,為探索α7乙酰膽堿受體（α7 nAChR）介導(dǎo)gp120中樞神經(jīng)毒性的作用和機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。方法α7 nAChR基因敲除小鼠（α7R-/-）與HIV-1 gp120轉(zhuǎn)基因小鼠（gp120+）雜交（F0）,從產(chǎn)生的F1小鼠中,選取基因型為α7R+/-/gp120+的小鼠進(jìn)一步交配,得到F2小鼠。PCR法鑒定和篩選F3小鼠基因型,免疫組化分析雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型蛋白表達(dá);體外實(shí)驗(yàn)使用gp120蛋白和α7 nAChR抑制劑處理小膠質(zhì)細(xì)胞,ELISA檢測各組IL-1β與TNF-α表達(dá)情況。結(jié)果F3小鼠的PCR結(jié)果符合預(yù)期,其中有2只雙基因編輯成功的小鼠。免疫組化結(jié)果顯示雙基因編輯小鼠（α7R-/-/gp120+）的腦組織缺乏α7 nAChR的同時(shí)高表達(dá)gp120蛋白。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Gp120可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β與TNF-α,而抑制α7nAChR后IL-1β與TNF-α表達(dá)明顯降低（P<0.001）。結(jié)論α7R-/-/gp120+雙基因修飾小鼠成功構(gòu)建,且具有穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn),可為后續(xù)探索α7 nAChR介導(dǎo)gp120中... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2020年08期 第1184-1191頁 北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

圖1 雙基因編輯小鼠構(gòu)建示意圖

通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)F0小鼠進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果顯示，以α7nAChR敲除為親本的雌性小鼠1～5號(hào)在187 bp處均有條帶，提示基因型均為α7R-/-的純合子；以gp120轉(zhuǎn)基因?yàn)橛H本的雄性小鼠Ⅰ～Ⅳ號(hào)在220 bp處均有條帶，Ⅴ號(hào)小鼠在220 bp處無條帶，表示Ⅰ～Ⅳ號(hào)基因型為gp120+，Ⅴ號(hào)小鼠基因型為gp120-（圖2），剔除Ⅴ號(hào)，選取其余小鼠作為親本。2.2 F1小鼠基因型鑒定

基因編輯技術(shù)、受精卵原核注射法和雜交繁殖技術(shù)是建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型常用的技術(shù)手段，最早建立且發(fā)展較成熟的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型就是轉(zhuǎn)基因小鼠，其繁殖方便，周期相對(duì)較短，成本低等一系列優(yōu)點(diǎn)使得轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建更加省時(shí)省力[19]。本次研究主要利用雜交繁殖技術(shù)構(gòu)建了雙基因修飾小鼠模型（α7R-/-/gp120+），通過基因檢測證明α7nAChR基因敲除成功，且gp120顯示過表達(dá)。分析F0到F2代小鼠的基因型可以看出，α7nAChR敲除基因和gp120轉(zhuǎn)基因均能穩(wěn)定遺傳。進(jìn)一步，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)在小鼠腦組織中α7nAChR蛋白未表達(dá)，gp120蛋白高表達(dá)，從基因水平和蛋白表達(dá)水平上均證明雙基因編輯小鼠模型（α7R-/-/gp120+）構(gòu)建成功。為初步探索α7nAChR受體的功能，本研究使用α-銀環(huán)蛇毒素?zé)晒馊玖蠈?duì)野生型和α7nAChR敲除小鼠的腦組織進(jìn)行了染色。結(jié)果提示α7nAChR可與α-銀環(huán)蛇毒素結(jié)合，且進(jìn)一步說明α7nAChR敲除成功，從α7nAChR結(jié)合功能方面對(duì)小鼠進(jìn)行了鑒定。本次實(shí)驗(yàn)中使用的α7nAChR純合敲除小鼠具有生存率高，無明顯腦形態(tài)異常的特點(diǎn)。該模型小鼠是通過同源重組技術(shù)造成小鼠胚胎干細(xì)胞的7 kb基因片段缺失。該缺失片段包括了α7nAChR最后三個(gè)外顯子（8～10個(gè)外顯子），這些外顯子負(fù)責(zé)編碼α7nAChR第二跨膜結(jié)構(gòu)域（MII），形成離子通道和第三、第四跨膜結(jié)構(gòu)域[20]。且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該小鼠腦組織中缺乏高親和力的α-銀環(huán)蛇毒素結(jié)合位點(diǎn)。煙堿型乙酰膽堿受體在生物學(xué)、生理學(xué)和病理學(xué)等方面都發(fā)揮著重要作用，與感覺、認(rèn)知、疼痛和遞質(zhì)釋放等密切相關(guān)。α7nAChR是煙堿型膽堿能受體之一，能調(diào)控炎性反應(yīng)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子[14-15,18]，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茲海默癥[21-22]、帕金森病[23]、精神分裂癥[24-25]以及與炎癥反應(yīng)有關(guān)的危重癥[26]等多種疾病相關(guān)。目前認(rèn)為α7nAChR的抗炎作用可通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB和Janus活化激酶2信號(hào)傳感器和轉(zhuǎn)錄激活子3兩條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)[17,27]，也有研究證明激活α7nAChR可以增強(qiáng)單核/小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬[28]，從而抑制神經(jīng)炎癥。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]HIV-1包膜蛋白gp120在神經(jīng)元損傷誘發(fā)認(rèn)知障礙中的作用[J]. 萬宇,楊偉軍,龔澤龍,曾志節(jié),張漢運(yùn),呂柯瑤,曹虹.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2020(01)
[2]α7nAChR和nNOS在Aβ誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙大鼠皮質(zhì)及海馬表達(dá)的時(shí)間和空間變化[J]. 王艷莉,劉麗霞,王少虎,祁文秀.  生理學(xué)報(bào). 2016(06)
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