【摘要】：淋巴細(xì)胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene-3,LAG3)是表達(dá)在T細(xì)胞表面的抑制性受體(Inhibitory receptor,IR)。T細(xì)胞表達(dá)多種IRs,如T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(T-lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)和程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein-1,PD-1)等,來避免由于免疫反應(yīng)的失控導(dǎo)致的免疫細(xì)胞過度活化、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間和幅度、維持免疫耐受、避免組織損傷和自身免疫病的發(fā)生。但是IRs持續(xù)性的高表達(dá),可抑制T細(xì)胞功能,導(dǎo)致T細(xì)胞的無應(yīng)答,無法發(fā)揮免疫作用。靶向封閉IRs,使T細(xì)胞恢復(fù)活性已被證明可顯著增強(qiáng)抗病毒和抗腫瘤的免疫反應(yīng),這些IRs也因此被稱為免疫檢查點(diǎn)(immune checkpoint)。目前,靶向性封閉CTLA-4、PD-1或其配體PD-L1的治療手段已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療多種腫瘤,這表明了阻斷T細(xì)胞抑制性信號(hào)用于疾病治療的可行性。但是仍有很多患者未從這些藥物中獲益,因此仍然需要更多靶向各種類型免疫檢查點(diǎn)的研究。LAG3也是一種免疫檢查點(diǎn),當(dāng)其與MHCⅡ結(jié)合時(shí)可直接抑制T細(xì)胞活化的第一信號(hào),負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的功能。靶向封閉LAG3可通過抑制LAG3傳導(dǎo)的抑制信號(hào),顯著增強(qiáng)T細(xì)胞活性,進(jìn)而提高免疫反應(yīng)。目前,尚未見到靶向LAG3的寡核苷酸類抑制物的報(bào)道。在本研究中,設(shè)計(jì)了靶向LAG3的反義寡核苷酸,并探究了其維持T細(xì)胞反應(yīng)的效應(yīng)以及作為重組蛋白疫苗和滅活流感病毒疫苗佐劑的可能性。在探究靶向LAG3的反義寡核苷酸是否也能作為腫瘤疫苗佐劑增強(qiáng)抗腫瘤活性的研究中,我們意外的觀察到了Lewis肺癌腫瘤裂解物引起的小鼠十二指腸致死性壞死,并探討了此種壞死發(fā)生的可能原因。1.LAG3干擾反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)與篩選為了設(shè)計(jì)靶向LAG3的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASOs),利用NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫分別獲得人和小鼠的LAG3 mRNA序列,并通過BLAST網(wǎng)站篩選出可用于設(shè)計(jì)ASOs的保守區(qū)。在對保守區(qū)序列進(jìn)行特異性檢測后,篩選出15個(gè)可用于設(shè)計(jì)ASOs的靶向區(qū)域。然后,設(shè)計(jì)出15個(gè)與這些靶向區(qū)域完全反向互補(bǔ)的ASOs,并利用“sfold”和“mfold”網(wǎng)站以結(jié)合位點(diǎn)的二級結(jié)構(gòu)、結(jié)合自由能以及是否含有惰性序列作為篩選指標(biāo)對這些序列進(jìn)行評估。結(jié)果顯示,有兩個(gè)符合要求的LAG3干擾寡核苷酸(LAG3 interfering antisense oligonucleotides,LIOs),即LIO-1和LIO-2,可用于后續(xù)研究。2.LIO進(jìn)入免疫細(xì)胞的情況分析為了探究LIO能否進(jìn)入免疫細(xì)胞尤其是T細(xì)胞,將LIO-1和LIO-2分別標(biāo)記了Cy3熒光信號(hào)后,采用流式細(xì)胞術(shù)觀察了na?ve ICR小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞中的總T細(xì)胞、CD4~+T細(xì)胞、CD8~+T細(xì)胞、B細(xì)胞以及DC細(xì)胞對LIO-1及LIO-2的攝取情況。然后,利用免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步觀察了LIO是否能定位于T細(xì)胞內(nèi)部。結(jié)果顯示,淋巴結(jié)細(xì)胞及脾細(xì)胞中的主要免疫細(xì)胞均可攝取LIO-1和LIO-2,并且LIO-1和LIO-2可定位于CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞的內(nèi)部。結(jié)果提示:LIO-1和LIO-2均可以進(jìn)入T細(xì)胞內(nèi)部。3.LIO對T細(xì)胞LAG3表達(dá)的抑制效應(yīng)為了探究LIO-1和LIO-2是否可以抑制LAG3的表達(dá),首先利用RT-PCR技術(shù)檢測了LIO對脾細(xì)胞中LAG3 mRNA表達(dá)的影響,然后利用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測了LIO對脾和引流淋巴結(jié)中的T細(xì)胞以及人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系(Jurkat)細(xì)胞LAG3蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:1)LIO-1可抑制脾細(xì)胞中LAG3 mRNA的表達(dá),LIO-2無明顯作用;2)LIO-1可降低脾和引流淋巴結(jié)中CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞LAG3的表達(dá),LIO-2無此效果;3)LIO-1可減少Jurkat細(xì)胞表面LAG3的表達(dá),LIO-2仍然沒有顯著效果。由此可見,LIO-1可抑制LAG3的表達(dá),但是LIO-2未能發(fā)揮抑制作用。4.在recall反應(yīng)中LIO對抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的影響為了探究在recall反應(yīng)中LIO對抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的影響,分離了LIO聯(lián)合重組豬圓環(huán)病毒2b型(porcine circovirus type 2b,PCV2b)衣殼蛋白(CP)疫苗免疫的小鼠的脾細(xì)胞后,在體外使用CP蛋白再次刺激。然后利用T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測了抗原特異性CD4~+T和CD8~+T細(xì)胞的增殖情況。此外,還采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了上述脾細(xì)胞在CP刺激后,細(xì)胞因子干擾素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4和IL-6的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示:1)LIO-1可以顯著提高重組蛋白疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性CD4~+T細(xì)胞的增殖比例,但對抗原特異性CD8~+T細(xì)胞的增殖比例無明顯影響;2)LIO-1可顯著提高脾細(xì)胞中IFN-γ、IL-2和IL-6的mRNA表達(dá)水平。由此可見,在recall反應(yīng)中,當(dāng)再次暴露于抗原時(shí),LIO-1可以促進(jìn)重組蛋白疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性CD4~+T細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的產(chǎn)生。5.LIO對維持抗原特異性T細(xì)胞活化的影響為了進(jìn)一步探究在體內(nèi)LIO對維持抗原特異性T細(xì)胞活化的影響,本研究在小鼠第二次免疫LIO聯(lián)合重組CP蛋白疫苗48h后,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了小鼠引流淋巴結(jié)和脾中CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞表面T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69的表達(dá)情況。此外,本研究還利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了上述引流淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:1)LIO-1可提高重組蛋白疫苗誘導(dǎo)的引流淋巴結(jié)細(xì)胞中CD4~+CD69~+T細(xì)胞的比例。2)LIO-1可提高重組蛋白疫苗誘導(dǎo)的引流淋巴結(jié)細(xì)胞中IFN-γ和IL-2的mRNA表達(dá)。由此可見,LIO-1在體內(nèi)可維持引流淋巴結(jié)中CD4~+T細(xì)胞的活化,并可促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的產(chǎn)生。6.LIO對重組蛋白疫苗和滅活流感病毒疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)的促進(jìn)作用由于LIO-1可顯著增強(qiáng)CD4~+T細(xì)胞反應(yīng),這提示其有可能可以促進(jìn)重組蛋白疫苗和滅活流感病毒疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)。為了驗(yàn)證這一猜想,本研究使用間接ELISA技術(shù)檢測了LIO-1聯(lián)合重組CP蛋白疫苗或是聯(lián)合滅活FM1流感病毒疫苗免疫小鼠時(shí),誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)。結(jié)果顯示:1)LIO-1可顯著提高重組CP蛋白疫苗誘導(dǎo)的抗體水平;2)LIO-1可顯著提高滅活FM1流感病毒疫苗誘導(dǎo)的抗體水平。由此可見,LIO-1可作為佐劑,增強(qiáng)重組蛋白疫苗和滅活病毒疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)。7.CD8~+T細(xì)胞和IFN-γ與小鼠十二指腸壞死的相關(guān)性觀察在進(jìn)一步探究LIO-1是否也能作為腫瘤疫苗佐劑時(shí),我們意外的發(fā)現(xiàn)了Lewis肺癌腫瘤裂解物疫苗(LCLV)注射na?ve C57BL/6小鼠可引起廣泛的十二指腸致死性壞死。為了探究這一現(xiàn)象發(fā)生的原因,na?ve小鼠注射LCLV后,在小鼠瀕死時(shí),利用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測了小鼠外周血白細(xì)胞(peripheral white blood cells,PWBC)、脾細(xì)胞及引流淋巴結(jié)細(xì)胞中CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T的比例,并利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了小鼠PWBC和脾細(xì)胞中IFN-γmRNA的表達(dá)情況。注射生理鹽水的小鼠作為對照。結(jié)果顯示:1)注射LCLV的小鼠PWBC中CD8~+T細(xì)胞比例增高了5倍,達(dá)到約50%。2)相比于正常小鼠,注射LCLV的小鼠PWBC中IFN-γ表達(dá)水平迅速提高了約12倍。這提示,小鼠外周血中顯著的CD8~+T和IFN-γ產(chǎn)生的增高可能與十二指腸致死性壞死存在相關(guān)性。綜上所述,在本研究中,設(shè)計(jì)了靶向LAG3的反義寡核苷酸藥物(LIO-1),并證明LIO-1能進(jìn)入T細(xì)胞內(nèi)部;可誘導(dǎo)LAG3 mRNA的降解;抑制CD4~+T細(xì)胞LAG3的表達(dá);維持抗原特異性CD4~+T細(xì)胞的增殖;促進(jìn)CD4~+T細(xì)胞的活化;促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的產(chǎn)生;增強(qiáng)重組蛋白疫苗和滅活流感病毒疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)。因此,LIO-1作為LAG3的核酸類抑制劑,可以增強(qiáng)微生物疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng),有成為一種新型佐劑的潛能。此外,在本研究中還意外發(fā)現(xiàn)了小鼠外周血中顯著升高的CD8~+T細(xì)胞和IFN-γ產(chǎn)生可能與十二指腸致死性壞死存在相關(guān)性。這一發(fā)現(xiàn),如果能被進(jìn)一步證明,可能有助于在臨床上通過檢測外周血CD8~+T細(xì)胞和IFN-γ水平來提示患者發(fā)生十二指腸廣泛壞死的風(fēng)險(xiǎn)和通過降低外周血CD8~+T細(xì)胞和IFN-γ水平防止十二指腸廣泛壞死的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

激受體和抑制性受體共同作用調(diào)imulatory and inhibitory interacions of the ligand and receptor betpicted. Some of the ligand and recehile the others deliver inhibitory sigantigen 4; PD1: programmed cell P1: B7-related protein 1; ICOS: inducyte attenuator; KIR: killer cell immivation gene 3; HVEM: herpesvirul membrane protein 3; A2aR: adenotor-β; IL, interleukin.

LAG3結(jié)構(gòu)及sLAG3脫落[26]

聯(lián)系可提高 T 細(xì)胞反應(yīng)并增強(qiáng)抗腫瘤免疫效果。FGL1 在表達(dá)，并且 FGL-1 與 LAG3 的結(jié)合與腫瘤患者 PD-1 靶向]。觸核蛋白經(jīng)系統(tǒng)中的 -突觸核蛋白也可與 LAG3 結(jié)合[49]。LAG3的預(yù)成型原纖維（preformed fibrils, PFFs）強(qiáng)有力的結(jié)合過 PFFs 在神經(jīng)元間的病理性傳遞。這一過程與帕金森病森病發(fā)病機(jī)理中錯(cuò)誤折疊的 -突觸核蛋白在細(xì)胞間“阮病[50-52]。
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本文編號(hào)：2892086