發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 09:54

　　 目的:獲得一種新型靶向人Frizzled7(Fzd7)蛋白的人源化抗體。方法:首先用重組人Fzd7蛋白(rh Fzd7)免疫BALB/c小鼠,獲得鼠源抗Fzd7抗體(SHH002),并用生物膜層干涉技術(shù)(biolayer interferometry,BLI)檢測(cè)SHH002的親和力;測(cè)序獲得SHH002可變區(qū)序列(V區(qū)),通過(guò)與Human Germline序列庫(kù)比對(duì)選擇人源化設(shè)計(jì)模板,利用Discoverystudio軟件對(duì)SHH002進(jìn)行人源化設(shè)計(jì),獲得人源化抗Fzd7抗體SHH002-hu,并對(duì)SHH002-hu的純度和親和力進(jìn)行驗(yàn)證,最后通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證其抗腫瘤活性。結(jié)果:雜交瘤篩選技術(shù)獲得高親和力(親和力常數(shù)KD 1. 0×10-12mol·L-1)鼠源抗Fzd7抗體SHH002; SHH002 V區(qū)序列比對(duì)Human Germline序列庫(kù),選擇同源性最高的IGHV1/IGKV1作為人源化設(shè)計(jì)模板,保留對(duì)抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用的鼠源氨基酸,將非關(guān)鍵的位點(diǎn)突變?yōu)槿嗽窗被?獲得人源化程度高達(dá)98%的人源化抗體SHH002-hu;分子排阻色譜(SEC-HPLC)檢測(cè)其純度 95%,BLI法驗(yàn)證其KD 1. 0×10-12mol·L-1,MTT實(shí)驗(yàn)表明SHH002-hu可有效抑制三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)細(xì)胞的體外增殖。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)獲得了高度人源化且高親和力的靶向Fzd7抗體SHH002-hu,為多種惡性腫瘤提供一種全新的靶向治療候選方案。
【部分圖文】：

有限稀釋法經(jīng)3～4次克隆化操作，直至所有克隆化細(xì)胞孔檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)100%時(shí)，即可確定獲得分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株，挑選效價(jià)最高的4株單克隆(1#,2#,3#和11#)擴(kuò)大培養(yǎng)，并腹腔注射小鼠，7～10 d采集腹水。Western Blot檢測(cè)4株腹水與抗原的結(jié)合，圖1顯示4株腹水均檢測(cè)到目標(biāo)條帶，其中腹水1#,2#,3#效果較好。箭頭所指條帶為目的條帶所在位置，下部條帶疑為蛋白降解結(jié)合條帶(蛋白立春紅染色后在該位置有明顯條帶)。1.2 SDS-PAGE電泳初步鑒定抗體

SDS-PAGE電泳初步鑒定純化后抗體，如圖2所示。非還原條件下在150 kDa處出現(xiàn)目的條帶，主帶明顯;還原條件下在50和25 k Da處分別出現(xiàn)目的條帶(重鏈和輕鏈)，說(shuō)明1#,2#,3#抗體重輕鏈表達(dá)正確且裝配完全。1.3鼠源抗Fzd7抗體的免疫球蛋白亞型鑒定

間接ELISA測(cè)得的抗體親和力分別為:1#抗體:(4.06±0.24)×10-11mol·L-1(n=3);2#抗體:(9.74±0.64)×10-11mol·L-1(n=3);3#抗體:(7.59±0.58)×10-11mol·L-1(n=3)。ELISA法測(cè)得的反應(yīng)曲線如圖3A～C所示。挑選親和力最高的1#抗體(即SHH002)，用BLI法進(jìn)一步驗(yàn)證其親和力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SHH002與rhFzd7的結(jié)合常數(shù)(ka)=(2.85±0.17)×104mol-1·L·s-1，解離常數(shù)(kd)<1×10-7s-1,KD<1×10-12mol·L-1(n=3)，結(jié)合解離動(dòng)力學(xué)過(guò)程擬合曲線圖如圖3D所示。對(duì)比間接ELISA法，BLI法測(cè)得的SHH002親和力更高;分析其原因可能為BLI法中是將抗體偶聯(lián)在芯片上去捕捉流動(dòng)相中的抗原，相比間接ELISA法中將抗原包被在酶標(biāo)板上去捕捉抗體，更有效地規(guī)避了抗體抗原結(jié)合的空間位阻。以上結(jié)果說(shuō)明我們已經(jīng)成功獲得穩(wěn)定表達(dá)抗Fzd7抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并得到具有高親和力的鼠源抗Fzd7抗體SHH002。
【相似文獻(xiàn)】

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