目的探討通過(guò)添加TGF-β抑制劑SB431542控制人羊膜上皮細(xì)胞的干性、表型和間質(zhì)特性,為SB431542在預(yù)防人羊膜上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用提供依據(jù)。方法使用不同濃度SB431542培養(yǎng)P2代人羊膜上皮細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞的增殖曲線和基因水平(CK8、ACTA2、OCT4和KLF4)表達(dá)的差異,篩選出最適濃度。以不加SB431542的細(xì)胞為對(duì)照組,以加最適濃度的SB431542為實(shí)驗(yàn)組,比較不同代次的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞倍增時(shí)間,基因表達(dá)水平(CK8、CK19、OCT4、KLF4、Vimentin、ACTA2),流式檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物(CD146、CD105、SSEA4)和免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)情況(CK8、ACTA2、EpCAM)的差異。結(jié)果使用不同濃度SB431542培養(yǎng)P2代人羊膜上皮細(xì)胞,5μmol/L SB431542培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖曲線最優(yōu),且基因水平(CK8、ACTA2、OCT4和KLF4)表達(dá)最優(yōu),最終篩選最適藥物濃度為5μmol/LSB431542完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在5μmol/L SB431542培養(yǎng)條件下,P7代實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞倍增時(shí)間優(yōu)于對(duì)照組;P7代實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的CK8、CK19、KLF4、OCT4的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)組的ACTA2(α-SMA)和Vimentin表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)水平;P3和P5代細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組的間充質(zhì)標(biāo)志物CD146、CD105的表達(dá)量均比對(duì)照組的低,實(shí)驗(yàn)組干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA4的表達(dá)量均比對(duì)照組的高;P7代實(shí)驗(yàn)組的CK8和EpCAM表達(dá)效果強(qiáng)于P7代對(duì)照組細(xì)胞,且P7代實(shí)驗(yàn)組的α-SMA基本不表達(dá)。結(jié)論 5μmol/LSB431542在人羊膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)7個(gè)代次以內(nèi)可以有效地抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖2）表明，P1～P6人羊膜上皮細(xì)胞加藥和不加藥的細(xì)胞倍增時(shí)間基本一致。在P7代，加藥的細(xì)胞倍增時(shí)間為43.5 h，不加藥的細(xì)胞倍增時(shí)間為61.4 h。5μmol/L SB431542在7個(gè)代次內(nèi)可維持羊膜上皮細(xì)胞的增殖。圖2 5μmol/L SB431542對(duì)不同代次的人羊膜上皮細(xì)胞的倍增時(shí)間影響

圖1 5μmol/L SB431542為hAECs生長(zhǎng)的最佳的濃度（A：每天將CCK8加入不同濃度SB431542培養(yǎng)的細(xì)胞中，根據(jù)OD450讀數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線；B：使用qPCR檢測(cè)不同濃度SB431542培養(yǎng)的P2 hAECs的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平情況；*P<0.05)2.3 5μmol/L SB431542對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞的基因表達(dá)水平的影響

使用qPCR檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組P1、P3、P7代人羊膜上皮細(xì)胞的基因表達(dá)水平情況。使用的Marker為上皮標(biāo)志物角蛋白8(CK8）和19(CK19）、干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4和KLF4、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白和ACTA2（α-SMA）。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖3）來(lái)看，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在CK8、CK19、KLF4、OCT4、波形蛋白和ACTA2（α-SMA）的基因表達(dá)水平上都有顯著性差異（P<0.05）。且在P7代時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的CK8、CK19、KLF4、OCT4的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)水平；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的ACTA2（α-SMA）和波形蛋白明顯低于對(duì)照組的表達(dá)水平。2.4 5μmol/L SB431542對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物的影響
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