目的構(gòu)建穩(wěn)定表達熒光素酶基因(lux)的產(chǎn)酸克雷伯菌,旨在更直觀地觀察產(chǎn)酸克雷伯菌(K. oxytoca)在宿主體內(nèi)的分布以及評估不同殺菌方法的效果。方法擴增p BAV1k-T5-Lux質(zhì)粒的熒光素酶基因簇(Lux A/B/C/D/E),構(gòu)建含有Lux A/B/C/D/E基因簇的p BBR1質(zhì)粒(p BBR1-lux),并獲得能夠表達熒光素基因基團的大腸埃希菌(E. coli-p BBR1-lux)。將p BBR1-lux質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至產(chǎn)酸克雷伯菌感受態(tài)細胞,經(jīng)熒光強度鑒定及菌株的3次傳代,篩選能夠穩(wěn)定表達lux基因的產(chǎn)酸克雷伯菌(K. oxytoca-p BBR1-lux)。結(jié)果連接成功的環(huán)狀質(zhì)粒產(chǎn)物命名為p BBR1-lux。與大腸埃希菌對照株相比,含E. coli-p BBR1-lux的Luminesence熒光信號值顯著升高[15 345(14 676,18 654) vs. 63(60,82)],差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=21.14、P=0.035)。K.oxytoca-p BBR1-lux的Luminesence熒光信號值[399 303(265 245,617 192)]顯著高于產(chǎn)酸克雷伯菌對照菌株[83(63.5,86.75)],差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.07、P=0.014)。E. coli-p BBR1-lux和K. oxytoca-p BBR1-lux均能夠在Veritas微孔板光度計和小動物成像儀上檢測到Luminesence熒光信號。將所得菌株按照1︰10稀釋6個梯度,熒光值檢測結(jié)果顯示,Luminesence值隨菌落濃度降低而下降。多次傳代后p BBR1-lux能夠在產(chǎn)酸克雷伯菌中穩(wěn)定表達熒光素酶,不同理化殺菌方法對產(chǎn)酸克雷伯菌殺菌效果不同,紫外線和84消毒液(10%)是最有效的殺滅產(chǎn)酸克雷伯菌方法。結(jié)論本研究獲得了可被微孔板光度計和小動物成像儀檢測到的穩(wěn)定表達熒光素酶的K. oxytoca-p BBR1-lux。
【部分圖文】：

中華實驗和臨床感染病雜志(電子版)2020年8月第14卷第4期ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),August2020,Vol.14,No.4·275·注：A：E.coli-pBBR1-lux的熒光值顯著高于對照菌株；B：E.coli-pBBR1-lux在小動物活體成像儀上可見熒光。*：差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）圖2E.coli-pBBR1-lux能夠穩(wěn)定表達熒光素酶注：A：K.oxytoca-pBBR1-lux的熒光值顯著高于對照菌株K.oxytoca-Control；B：K.oxytoca-pBBR1-lux在小動物活體成像儀上可見熒光。*：差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）圖3K.oxytoca-pBBR1-lux穩(wěn)定表達熒光素酶的Luminesence熒光信號值顯著升高[15345（14676，18654）vs.63（60，82）]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=21.14、P=0.035）。IVISLuminaLT小動物活體成像儀檢測結(jié)果顯示，E.coli-pBBR1-lux成像儀上可見熒光，見圖2。三、K.oxytoca-pBBR1-lux表達熒光素酶功能驗證在液體LB培養(yǎng)基中大量擴增E.coli-pBBR1-lux，并提取pBBR1-lux質(zhì)粒。將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至產(chǎn)酸克雷伯菌感受態(tài)細胞中。在含有氯霉素的哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上篩選氯霉素耐藥的陽性菌落。陽性菌落經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，使用Veritas微孔板光度計檢測其Luminesence值，選取第3代（P3）有Luminesence信號的菌落命名為K.oxytoca-pBBR1-lux；同時，K.oxytoca-pBBR1-lux的Luminesence熒光信號值[399303（265245，617192）]顯著高于產(chǎn)酸克雷伯菌對照菌株[83（63.5，86.75）]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.07、P=0.014），使用IVISLumin

第14卷第4期ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),August2020,Vol.14,No.4·275·注：A：E.coli-pBBR1-lux的熒光值顯著高于對照菌株；B：E.coli-pBBR1-lux在小動物活體成像儀上可見熒光。*：差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）圖2E.coli-pBBR1-lux能夠穩(wěn)定表達熒光素酶注：A：K.oxytoca-pBBR1-lux的熒光值顯著高于對照菌株K.oxytoca-Control；B：K.oxytoca-pBBR1-lux在小動物活體成像儀上可見熒光。*：差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）圖3K.oxytoca-pBBR1-lux穩(wěn)定表達熒光素酶的Luminesence熒光信號值顯著升高[15345（14676，18654）vs.63（60，82）]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=21.14、P=0.035）。IVISLuminaLT小動物活體成像儀檢測結(jié)果顯示，E.coli-pBBR1-lux成像儀上可見熒光，見圖2。三、K.oxytoca-pBBR1-lux表達熒光素酶功能驗證在液體LB培養(yǎng)基中大量擴增E.coli-pBBR1-lux，并提取pBBR1-lux質(zhì)粒。將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至產(chǎn)酸克雷伯菌感受態(tài)細胞中。在含有氯霉素的哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上篩選氯霉素耐藥的陽性菌落。陽性菌落經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，使用Veritas微孔板光度計檢測其Luminesence值，選取第3代（P3）有Luminesence信號的菌落命名為K.oxytoca-pBBR1-lux；同時，K.oxytoca-pBBR1-lux的Luminesence熒光信號值[399303（265245，617192）]顯著高于產(chǎn)酸克雷伯菌對照菌株[83（63.5，86.75）]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.07、P=0.014），使用IVISLuminaLT小動物活體成像儀檢測結(jié)果顯示，K.oxytoca-pBBR1

·276·中華實驗和臨床感染病雜志(電子版)2020年8月第14卷第4期ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),August2020,Vol.14,No.4度計檢測細菌A600值。依據(jù)A600=109c.f.u計算細菌濃度[15-16]。將所得菌株按照1︰10稀釋6個梯度，在酶標儀上檢測熒光值，結(jié)果顯示Luminesence值隨菌落濃度降低而下降，當菌株濃度為106c.f.u和105c.f.u時，其熒光強度分別為（5869±215.9）和（660.2±215.9），見圖5。六、不同處理方式對K.oxytoca-pBBR1-lux殺菌效果的驗證紫外燈和84消毒液殺菌效果最強（完全殺菌：平板上未見K.oxytoca-pBBR1-lux）。酒精、H2O2和NaOH（0.4%，4%）不能夠完全殺滅K.oxytoca-pBBR1-lux（不完全殺菌：平板上可見K.oxytoca-pBBR1-lux），見圖6。討論本研究結(jié)果顯示，當細菌濃度為103c.f.u/ml時，其熒光強度與陰性對照差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故該細菌如果用于動物實驗時，其在動物體內(nèi)富集濃度不能低于104c.f.u/ml。產(chǎn)酸克雷伯菌屬于革蘭陰性腸桿菌，是院內(nèi)感染和外科手術(shù)感染最常見的病原菌之一，產(chǎn)酸克雷伯菌感染與青霉素及其他抗菌藥物使用相關(guān)[15-17]，研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)酸克雷伯菌能夠?qū)μ记嗝瓜┠退帲o臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[18-20]。故研發(fā)新的抗菌藥物和尋找新的殺菌方法對于臨床應(yīng)對多耐藥菌具有重要意義，而目前對于抗菌藥物殺菌效果圖5不同濃度K.oxytoca-pBBR1-lux的Luminescence熒光強度圖6不同理化殺菌方法對K.oxytoca-pBBR1-lux的殺菌效果圖4傳代至第十代后K.oxytoca-pBBR1-lux穩(wěn)定表達熒光素酶
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