鼠衣原體(Chlamydia muridarum,Cm)tc0668是參與鼠衣原體致小鼠輸卵管炎癥病變的染色體基因。將獲得的TC0668未突變單克隆菌株(Cm TC0668~(wt))與TC0668突變的單克隆菌株(Cm TC0668~(mut))同時(shí)接種小鼠建立小鼠生殖道感染模型,與Cm TC0668~(wt)菌株相比,Cm TC0668~(mut)菌株致小鼠生殖道病變率大大減低。本課題組前期的研究工作中發(fā)現(xiàn),TC0668蛋白是定位于衣原體原體(Elementary body,EB)/網(wǎng)狀體(Reticulate body,RB)膜上的結(jié)構(gòu)蛋白,且在鼠衣原體發(fā)育周期的中后期(16 h左右)表達(dá)相對(duì)較高,該蛋白通過調(diào)控宿主細(xì)胞炎癥因子的分泌參與衣原體致病。但TC0668在Cm致病過程中的分子機(jī)制尚不明確。由于TC0668是一種新發(fā)現(xiàn)的毒力因子,缺乏可供參考的同源蛋白進(jìn)行致病機(jī)制的研究和分析,我們需要一種有效的技術(shù)方法對(duì)可能參與TC0668致病的相關(guān)分子和信號(hào)通路進(jìn)行全面的篩選和分析。同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ技術(shù))是近年來新開發(fā)的比較先進(jìn)的標(biāo)記型蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù),該技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)篩選差異蛋白靈敏度高,檢測(cè)平行性和穩(wěn)定性較好,適用范圍廣,檢測(cè)通量高,目前已經(jīng)運(yùn)用到多種病原菌致病機(jī)制的研究。目的通過Cm TC0668~(wt)菌株和Cm TC0668~(mut)菌株分別感染HeLa細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞感染模型,經(jīng)iTRAQ標(biāo)記結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)建立兩種菌株HeLa細(xì)胞感染樣品的差異蛋白數(shù)據(jù)庫(kù),分析差異蛋白的來源及生物功能,篩選可能參與TC0668致病的相關(guān)分子和信號(hào)通路。方法將Cm TC0668~(wt)菌株與Cm TC0668~(mut)菌株分別感染HeLa細(xì)胞,在6 h、12 h、18 h、24 h收集感染細(xì)胞樣品,采用iTRAQ技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)分析樣品成分,建立多個(gè)樣品的全細(xì)胞蛋白表達(dá)譜,應(yīng)用Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4軟件進(jìn)行查庫(kù)鑒定和定量分析,構(gòu)建兩種菌株細(xì)胞感染模型的差異蛋白數(shù)據(jù)庫(kù);應(yīng)用Blast2GO、KAAS及CytoScape等生物信息學(xué)方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行基因本體(GO)分子功能注釋、KEGG信號(hào)通路及蛋白質(zhì)相互作用分析,預(yù)測(cè)差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能和參與的信號(hào)通路;qRT-PCR和Western blotting分別從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證差異蛋白檢測(cè)結(jié)果;并進(jìn)一步鑒定相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子PI3K和NF-κB的表達(dá)。結(jié)果成功建立了感染指數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為1,可平行對(duì)照的Cm TC0668~(wt)菌株和Cm TC0668~(mut)菌株的HeLa細(xì)胞感染模型,感染細(xì)胞樣品經(jīng)iTRAQ標(biāo)記結(jié)合LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)在衣原體發(fā)育的中后期(感染后18 h)共鑒定了550個(gè)差異表達(dá)蛋白,與Cm TC0668~(wt)感染細(xì)胞樣品相比,Cm TC0668~(mut)感染細(xì)胞樣品中222個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),328個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。經(jīng)GO功能分析,差異表達(dá)蛋白主要與細(xì)胞的結(jié)合活性、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)分子活性、分子功能活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性等相關(guān)。GO功能注釋顯示:差異蛋白的功能主要涉及分子功能、細(xì)胞組分和生物過程三方面。生物過程包括:纖溶酶原活化的調(diào)控、防御反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)、角化作用及脂質(zhì)反應(yīng)負(fù)調(diào)控。分子功能包括:組成表皮結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)因子結(jié)合、受體活性及膽固醇結(jié)合等。細(xì)胞組分包括:膜成分、高密度脂蛋白顆粒及角蛋白纖維等。蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)分析顯示:各差異表達(dá)蛋白之間存在著直接或間接的相互作用。KEGG通路分析顯示:差異蛋白與多條信號(hào)通路相關(guān),主要涉及了補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、PPAR信號(hào)通路、Fc gamma R介導(dǎo)的吞噬、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路及NOD樣受體信號(hào)通路等;隨機(jī)挑取10個(gè)差異蛋白進(jìn)行mRNA水平的qRT-PCR,證實(shí)Cm TC0668~(wt)感染細(xì)胞樣品中IFI16、TRAFD1和MAPKAPK2蛋白的mRNA表達(dá)水平上調(diào),SRPRB、JAK1、BCAP31、THBS1、PMM1、ITPR1和HLA-DQB1蛋白的mRNA表達(dá)水平下調(diào),與蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致。Western blotting驗(yàn)證JAK1蛋白表達(dá)水平,JAK1表達(dá)量在TC0668~(wt)樣品組中隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)而增加,TC0668~(mut)樣品組JAK1的表達(dá)逐漸減弱,與蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致。在信號(hào)通路活化的檢測(cè)中,結(jié)果顯示:Western blotting檢測(cè)兩組細(xì)胞感染樣品中NF-κB表達(dá)水平均隨著感染時(shí)間逐漸增加,TC0668~(wt)組NF-κB分子上調(diào)水平明顯高于TC0668~(mut)組,并且,IFA檢測(cè)TC0668~(mut)與TC0668~(wt)菌株感染的HeLa細(xì)胞中NF-κB的活化情況,TC0668~(wt)組中,隨著感染時(shí)間的增加,NF-κB逐漸入核,且24 h全部入核,TC0668~(mut)組的NK-kB從感染后6 h到24 h逐漸入核,24 h仍有少量NF-κB位于核外;兩組細(xì)胞樣品的ERK磷酸化水平無明顯差異;TC0668~(wt)組PI3K分子的表達(dá)水平明顯高于TC0668~(mut)組,而且,作為PI3K信號(hào)通路上重要表達(dá)分子,腫瘤抑制因子p53在感染中后期的的表達(dá)水平也明顯低于TC0668~(mut)組。結(jié)論兩組在tc0668上存在單基因差異的兩種衣原體菌株感染細(xì)胞所引起的宿主差異蛋白,可能參與細(xì)胞代謝、免疫應(yīng)答和生物調(diào)控過程;鼠衣原體TC0668可能通過PI3K、NF-κB等信號(hào)通路來發(fā)揮致病作用。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R374
【部分圖文】：

B. TC0668mutA. TC0668wt圖 1 熒光顯微鏡下 40 倍下檢測(cè)衣原體感染 HeLa 細(xì)胞 24 h 形成的包涵體數(shù)目Fig.1 Fluorescence microscopy was used to detect the number of inclusion bodiesformed by chlamydia strain in 24 hours after infection with HeLa cells(×40).

PCR 檢測(cè) Cm TC0668wt-HeLa 細(xì)胞與 Cm TC0668mut-HeLa 細(xì)胞p8 的 gene copy number同時(shí)間點(diǎn)兩組菌株感染細(xì)胞后的 DNA（設(shè)置三個(gè)重復(fù)樣本），測(cè)并獲得八組樣本 tc0668 與 pgp8 的 Cq 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式獲得gene copy number。結(jié)果分析，pgp8 在兩組菌株感染的 HeLa 細(xì)胞中接免疫熒光法檢測(cè)感染了 Cm TC0668wt或 Cm TC0668mut菌株的 HeLa 細(xì)胞。光 20 倍下分別在 6、12、18 和 24 h 拍攝到感染衣原體的 HeLa 細(xì)胞，其中 TC0668wt68mut包涵體均可在每小時(shí) 12 h 內(nèi)被觀察到，TC0668 蛋白(紅色)僅在 18 和 24 h的 TC0668wt包涵體中可見ndirect immunofluorescence assay (IFA) of HeLa cells infected with Cm TC0668wtor68mutstrain. Chlamydia-infected HeLa cells cultures were photographed unfixed byoptics microscope at 6, 12, 18 and 24 h p.i. Both TC0668wtand TC0668mutinclusionsible by 12 h p.i. The TC0668 protein (red) is only visible in TC0668wtinclusions at 18and 24 h p.i. Magnifications, x 200.

圖 3 qRT-PCR 分析 TC0668wt和 TC0668mut衣原體感染時(shí) tc0668 基因拷貝數(shù)，質(zhì)�；� 為對(duì)照。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)，點(diǎn)代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差Fig.3 qRT-PCR analysis of tc0668 gene copy number during infection with TC0668wtand TCchlamydial strain, plasmid gene pgp8 was a control. Three biological replicates each time poidone, points represent means and standard errors.
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張艷萍;;支原體衣原體感染在不孕癥中的影響[J];中國(guó)醫(yī)藥科學(xué);2012年14期

2 王輝萼;;頭頸部的衣原體感染[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).耳鼻咽喉科學(xué)分冊(cè);1987年02期

3 劉錦蓮;;衣原體疾患在性伴中的傳播[J];地方病譯叢;1988年03期

4 謝晉漢;;人類的衣原體感染概況[J];地方病譯叢;1988年06期

5 王士仁;女性生殖器衣原體感染現(xiàn)狀[J];實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志;1988年06期

6 林峰;新生兒衣原體感染[J];實(shí)用兒科雜志;1988年05期

7 野口昌良;呂虹;;圍產(chǎn)期感染癥:衣原體感染[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè);1988年06期

8 韓國(guó)柱;;一種提高衣原體檢出率和降低費(fèi)用的新方法[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).皮膚病學(xué)分冊(cè);1988年03期

9 張學(xué)禮;用遺傳基因診斷衣原體感染病[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;1989年11期

10 王同正;楊繼紅;張民選;;對(duì)非淋球菌性尿道炎的正確認(rèn)識(shí)和處理[J];湖北醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);1989年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 喬賽;衣原體感染中免疫細(xì)胞的相互作用及對(duì)過敏的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

2 張玉陽(yáng);CPAF、STING和MyD88在鼠型衣原體生殖道感染中的作用研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

3 邵麗麗;質(zhì)粒在衣原體胃腸道定植中的作用及其對(duì)生殖道致病的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

4 郭睿;衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白VP1的優(yōu)化表達(dá)及其生物學(xué)效應(yīng)的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉娜;鼠衣原體tc0668單基因差異型菌株體外感染差異蛋白及相關(guān)通路的篩選[D];南華大學(xué);2019年

2 陳浩;鼠衣原體TC0668蛋白生物學(xué)特性的初步研究[D];南華大學(xué);2018年

3 茍林鳳;PGRN在小鼠衣原體肺部感染中作用的研究[D];山東大學(xué);2018年

4 孫麗妲;IL-27/IL-27R信號(hào)途徑在宿主抗衣原體感染中的作用及機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

5 宋玉春;支原體、衣原體感染與異位妊娠的相關(guān)性研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

6 岑雯;1533例泌尿生殖道支原體/衣原體感染及相關(guān)因素分析[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

7 韓周紅;女性生殖道衣原體感染IL-2、IL-6的檢測(cè)及意義[D];山西醫(yī)科大學(xué);2009年

8 李長(zhǎng)鋒;地塞米松調(diào)節(jié)衣原體感染的中性粒細(xì)胞活性的免疫機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2018年

9 虞成超;心理干預(yù)對(duì)生殖道支原體、衣原體感染患者臨床療效的影響[D];南昌大學(xué);2010年

10 李成敏;宮頸及陰道局部用藥為主治療女性生殖道衣原體、支原體感染的臨床療效評(píng)估[D];吉林大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2883753