發(fā)布時間：2020-11-13 09:26

　　 結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病危害嚴(yán)重,是傳染性較強(qiáng)的全球慢性感染病之一,具有潛伏感染的特性.結(jié)核分枝桿菌來源的RNA解旋酶RhlE依賴于ATP水解活性,參與RNA代謝,調(diào)節(jié)核糖體的裝配與降解,但是其催化機(jī)制和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)尚不清楚.本文對RhlE進(jìn)行了體外表達(dá)純化、動態(tài)光散射和酶活性檢測研究.結(jié)果表明RhlE在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá),動態(tài)光散射(DLS)分析顯示其主要以單體的形態(tài)分布在溶液中.在ATP/Mg離子的輔助下可以高效解旋雙鏈RNA,小角散射實(shí)驗(yàn)表明RhlE具有與同源家族蛋白類似的三維結(jié)構(gòu).
【部分圖文】：

RhlE蛋白的SAXS分析

酶活性質(zhì)測定所用的RNA底物均購自金唯智公司，序列如下：Cy5標(biāo)記的RNA單鏈，Cy5-5′-GCUUUACGGUG-3′；Cy3標(biāo)記的RNA單鏈，5′-AACAAAACAAAAUAGCACCGUAAAGC-3′-Cy3；未標(biāo)記的RNA單鏈，5′-UAGCACCGUAAAGC-3′．RNA粉末溶于DEPC水，Cy5標(biāo)記的RNA單鏈與Cy3標(biāo)記的RNA單鏈共20μmol/L，在75mmol/L KCl和10mmol/L Hepes-Na(pH 7.5）緩沖液中室溫孵育10min，構(gòu)成復(fù)合物底物（圖1）．此復(fù)合物在解旋酶RhlE的解旋作用下打開雙鏈，Cy3熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，由Cy3至Cy5的熒光偏振強(qiáng)度減弱．RhlE解旋緩沖液為：10mmol/L Hepes-Na(pH 7.5),60mmol/L NaCl,55mmol/L KCl,5%（體積比）甘油．反應(yīng)體系包括20nmol/L雙熒光基團(tuán)復(fù)合物，0.2μmol/L未標(biāo)記的RNA單鏈，和2mmol/L ATP/Mg，最后加入RhlE蛋白（0.6μmol/L）．底物熒光基團(tuán)（Cy3）在500nm波長處激發(fā)，565nm波長處發(fā)射．與此同時，Cy3到Cy5兩熒光基團(tuán)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移由540nm波長處激發(fā)，由665nm波長處發(fā)射．參考文獻(xiàn)[23]，通過M5e酶標(biāo)儀（美谷分子儀器上海有限公司SpectraMax M5）進(jìn)行檢測，所有實(shí)驗(yàn)均有3組平行．

為了揭示蛋白RhlE的潛在催化活性位點(diǎn)，將RhlE和DEAD-box家族的其他同源酶類（包括嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的CshA，幽門螺旋桿菌來源的RhpA，蠟樣芽胞桿菌來源的CshE，豌豆蚜來源的DeaD）進(jìn)行了多序列同源比對，結(jié)果見圖2．二級結(jié)構(gòu)比對是基于CshA的晶體結(jié)構(gòu)通過Clustal W(https：∥www.genome.jp/tools-bin/clustalw）進(jìn)行的，然后用ESPript3.0(http：∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgibin/ESPript.cgi）進(jìn)行顯示．結(jié)果表明RhlE與其他幾個酶均具有較多共有的區(qū)域，這表明RhlE確實(shí)屬于DEAD-box家族．2.2 RhlE蛋白的表達(dá)和純化
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