目的:腫瘤免疫治療過去20年的發(fā)展引起了研究者對于抗腫瘤疫苗的關(guān)注�；跇渫粻罴�(xì)胞(DCs)利用納米技術(shù)制備的抗腫瘤疫苗是一種有效的激發(fā)體內(nèi)特異性免疫反應(yīng)的途徑,近年來國內(nèi)外都有廣泛的研究。聚(β-氨基酯)陽離子聚合物(PBAE)具有合成簡單,結(jié)構(gòu)易修飾,生物可降解性以及pH敏感等性質(zhì),是一種極具潛力的抗原載體,能夠在體內(nèi)裝載并保護(hù)抗原,遞送至DCs細(xì)胞識別呈遞,刺激免疫反應(yīng)的發(fā)生,發(fā)揮特異性的抗腫瘤免疫作用。方法:本研究通過經(jīng)典的邁克加成反應(yīng)合成聚(β-氨基酯)類聚合物,通過硬脂胺(SA)的修飾包載腫瘤相關(guān)抗原(TAA)多肽Trp-2和免疫佐劑單磷酰脂質(zhì)A(MPLA),制備成納米疫苗,并通過甘露糖的封端修飾,增加T/M@mPS納米疫苗的DCs細(xì)胞靶向性。通過核磁共振氫譜(~1H-NMR),傅里葉變換紅外光譜(FTIR),動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和透射電子顯微鏡(TEM)等方法確認(rèn)聚合物結(jié)構(gòu)和納米粒形態(tài)。同時(shí)利用小動(dòng)物活體成像、流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等方法在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證T/M@mPS納米疫苗的靶向性以及激發(fā)體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力。為了進(jìn)一步提高納米疫苗的療效,在小鼠黑色素瘤模型中利用PBAE納米疫苗與免疫檢查點(diǎn)PD-L1抑制劑聯(lián)合治療,對其聯(lián)合治療的預(yù)防和免疫效果進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果:PBAE聚合物可以較好地包載腫瘤相關(guān)抗原多肽Trp-2,并形成粒徑為150nm左右的穩(wěn)定納米粒。甘露糖的修飾使納米疫苗在體內(nèi)外都具有較好的靶向性,并可以刺激DCs細(xì)胞熟化,進(jìn)而增強(qiáng)體內(nèi)殺傷性T細(xì)胞的增殖分化。聯(lián)合PD-L1療法后,顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤免疫效果。結(jié)論:PBAE聚合物作為一種結(jié)構(gòu)易調(diào)控的陽離子聚合物載體,促進(jìn)了抗原多肽的遞送,激發(fā)了體內(nèi)特異性的免疫反應(yīng),在多肽疫苗的構(gòu)建上具有廣泛的應(yīng)用前景,為腫瘤免疫治療提供了新思路。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

/M@mPS納米疫苗的制備及其激活免疫效應(yīng)流程圖

圖 2 man-PBAE-S 的合成路徑圖（1）反應(yīng)前，溶劑 DMF 用足量 CaH2浸泡兩天除水，然后過濾在干燥器中保存。DCM 先用 CaH2浸泡兩天后，重蒸后得到無水 DCM，放在干燥器中保存；（2）man-PBAE-S 聚合物通過兩步邁克加成反應(yīng)得到。第一步為 PBAE-S 的聚合。硬脂胺（SA），1,4-丁二醇二丙烯酸酯（BDD）和 4,4’-三亞甲基二哌啶（TDP）按照摩爾質(zhì)量比 1:9:10 和 0.5:9.5:10（質(zhì)量 0.27g：1.78g：2.1g；0.14g：1.88g：2.1g）稱取，溶解到 5mL 無水 DMF 中。鼓氮排氧后，在 90oC 油浴鍋里反應(yīng) 72 小時(shí)；（3）反應(yīng)完成后，反應(yīng)液冷卻至室溫，用 50mL 二氯甲烷稀釋，此時(shí)有少量絮狀物析出。減壓抽濾除去絮狀物，DCM 洗滌后，收集濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽去濾液中的溶劑，得到淡黃色的粗產(chǎn)物；（4）粗產(chǎn)物用少量 DCM 溶解后，裝入分子量為 1000 的透析袋（透析袋提前活化），用 DCM 和 DMF 的混合溶劑(1:1, v:v)透析兩天，除去沒有反應(yīng)完的單體。兩天后，

圖 3 PBAE、PBAE-S、man-PBAE-S 核磁共振氫譜圖（H-NMR）由于前期的研究發(fā)現(xiàn)單純的 PBAE 對疏水性多肽 Trp-2 的包封率不高，多肽損失較大。引入硬脂胺單體，增加主鏈段的疏水能力，提高多肽的包封率，使 PBAE成為一種可調(diào)控的多肽載體。甘露糖胺的加入，使其結(jié)構(gòu)上的胺基與 PBAE 兩端的烯鍵加成，成為具有甘露糖受體靶向的聚合物載體，幫助 PBAE 納米粒在體內(nèi)外靶向 DCs 細(xì)胞，增強(qiáng)其遞送抗原的精準(zhǔn)性，提高疫苗的療效。PBAE、PBAE-S、man-PBAE-S 的核磁氫譜如圖 3 所示，PBAE 和 PBAE-S 在5.8 到 6.5 的范圍內(nèi)有明顯由兩個(gè) d 峰，一個(gè) dd 峰構(gòu)成的雙鍵峰型�；瘜W(xué)位移在4.07(f)、1.67(h) ppm 位置上的信號是典型屬于 BDD 結(jié)構(gòu)單元上-CH2CH2-O-CO-的質(zhì)子化學(xué)位移。而化學(xué)位移在 2.63(d)、2.48(d’)、1.60(e)、1.15(e’,i) ppm 位置上的信號同樣是典型的屬于 TDP 結(jié)構(gòu)單元上哌啶環(huán)內(nèi)-N-CH2CH2CH 上質(zhì)子的信號。2.85(c)、1.91(g)的形成說明了 BDD 上的雙鍵和 TDP 上的二級胺加成形成了新的碳氮鍵，說明 PBAE 合成成功。在 PBAE-S 和 man-PBAE-S 的氫譜圖上出現(xiàn)了硬脂胺鏈上亞甲
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本文編號：2881016