目的制備抗新孢子蟲致密顆粒蛋白NcGRA16和原癌基因調(diào)控蛋白NcMYR2多克隆抗體,對(duì)NcGRA16和NcMYR2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位;構(gòu)建NcGRA16基因敲除蟲株(△NcGRA16)和NcMYR2基因敲除蟲株(△NcMYR2),探究NcGRA16和NcMYR2蛋白在蟲體入侵、生長(zhǎng)及致病中的作用。方法原核表達(dá)NcGRA16和NcMYR2蛋白,純化后免疫小鼠,制備抗NcGRA16和NcMYR2蛋白多克隆抗體,免疫熒光法觀察NcGRA16和NcMYR2蛋白亞細(xì)胞定位;運(yùn)用CRISPR-cas9技術(shù)構(gòu)建△NcGRA16和△NcMYR2蟲株,通過噬斑試驗(yàn)、入侵試驗(yàn)、增殖試驗(yàn)、逸出試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)探究NcGRA16和NcMYR2蛋白在蟲體入侵、生長(zhǎng)及致病中的作用。結(jié)果成功制備抗NcGRA16和NcMYR2蛋白多克隆抗體,免疫熒光法觀察NcGRA16蛋白定位于蟲體致密顆粒中,NcMYR2蛋白定位于蟲體高爾基體;成功構(gòu)建△NcGRA16和△NcMYR2蟲株,與野生蟲株相比△NcGRA16蟲株的噬斑面積減小(P0.05);入侵率降低(P0.05)。與感染野生蟲株小鼠相比,感染△NcGRA16蟲株的小鼠死亡時(shí)間延長(zhǎng)3～5d;血清中IL-6和INF-γ顯著下降(P0.05);腦、心和脾荷蟲量顯著降低(P0.05);腦和心臟病理變化減輕。感染△NcMYR2蟲株的小鼠死亡時(shí)間延長(zhǎng)1～2d;血清中IL-6水平顯著下降(P0.05)。結(jié)論NcGRA16為新孢子蟲入侵和毒力相關(guān)基因,敲除NcMYR2基因?qū)οx體的生長(zhǎng)、入侵及毒力等無明顯影響,這為揭示新孢子蟲致病機(jī)制和新孢子蟲病防控提供了理論依據(jù)。
【部分圖文】：

以上述抗體為一抗對(duì)新孢子蟲進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)，鏡下可見NcGRA16蛋白定位于速殖子致密顆粒（圖1B),NcMYR2蛋白定位于速殖子高爾基體（圖1C）。2△NcGRA16和△NcMYR2蟲株構(gòu)建及鑒定

△NcGRA16和△NcMYR2蟲株鑒定

討論Leineweber等[14]報(bào)道新孢子蟲GRA9從蟲體致密顆粒分泌到納蟲空泡膜上，并可轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞核內(nèi)。Dong等[15-16]報(bào)道新孢子蟲GRA6/GRA7蛋白定位于納蟲空泡膜上，并維持納蟲空泡網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。但新孢子蟲GRA16定位及功能尚不清楚。弓形蟲TgGRA16屬于外分泌蛋白，通過蟲體細(xì)胞膜與納蟲空泡膜進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)中。TgGRA16敲除后，弓形蟲入侵率降低，蟲體毒力降低。TgGRA16蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞核，與泛素特異性蛋白酶（HAUSP）或蛋白磷酸酶2(PP2A）形成高親和力復(fù)合物。HAUSP充當(dāng)腫瘤抑制因子p53穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)劑，TgGRA16與HAUSP形成的復(fù)合物上調(diào)p53抑癌通路基因，而TgGRA16與PP2A結(jié)合可下調(diào)原癌基因表達(dá)量，從而抑制宿主細(xì)胞增殖[17]。本研究結(jié)果顯示，NcGRA16蛋白亞細(xì)胞定位于蟲體致密顆粒，入侵后未進(jìn)入宿主細(xì)胞，也未進(jìn)入納蟲空泡。敲除NcGRA16基因后蟲體入侵率降低，與感染野生蟲株小鼠相比，感染△NcGRA16蟲株的小鼠血清中IL-6、INF-γ水平下降，腦、心和脾荷蟲量降低，腦和心臟病理變化減輕，顯示△NcGRA16蟲株對(duì)小鼠致病性減弱，表明NcGRA16與蟲體入侵和毒力相關(guān)。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張瑞娟;人肺孢子蟲的新命名—耶氏肺孢子蟲(Pneumocystis jiroveci)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2003年02期

2 姜雨,安春麗;肺孢子蟲體外培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2005年05期

3 陳敬捷;李勇;何晗;蘇凌松;劉春明;秦松樹;唐柳生;李世立;胡宏波;;人型耶氏肺孢子蟲吉姆薩氏染色形態(tài)表達(dá)[J];柳州醫(yī)學(xué);2013年04期

4 李淑珍;黃敏君;安亦軍;盧思奇;郭增柱;;中國(guó)耶氏肺孢子蟲基因型的初步分析[J];寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào);2007年04期

5 李自慧;馮憲敏;盧思奇;張帆;王鳳云;黃松;;長(zhǎng)爪沙鼠源肺孢子蟲ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列測(cè)定及分析[J];首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年01期

6 何猛;免疫刺激復(fù)合物抗原ELISAs在診斷新孢子蟲和弓形蟲感染中的應(yīng)用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));1999年06期

7 邴玉艷;劉月華;安春麗;;大鼠支氣管肺泡灌洗液中肺孢子蟲的超微結(jié)構(gòu)觀察[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2007年04期

8 韓范,王榮芝,倪忠耘;一例腹瀉嬰兒糞便內(nèi)檢出圓孢子蟲[J];中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;1996年03期

9 陳雅棠;一種新發(fā)現(xiàn)的腹瀉病原蟲──圓孢子蟲（Cyclospore cayetanensis）[J];中國(guó)寄生蟲病防治雜志;1994年03期

10 李自慧;盧思奇;馮憲敏;張帆;王鳳云;黃松;;長(zhǎng)爪沙鼠和新西蘭白兔源肺孢子蟲ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的測(cè)定與分析[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2006年10期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 唐志元;雙基因敲除（H2-Ab1+H2-Eb1）小鼠的繁育、鑒定及其變應(yīng)性鼻炎模型的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2018年

2 李小麗;線粒體丙酮酸載體對(duì)糖代謝和干性調(diào)控的影響[D];鄭州大學(xué);2018年

3 梁爽;UT-B基因敲除雌性小鼠生殖延遲原因與機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張露允;β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2基因敲除對(duì)老年小鼠海馬神經(jīng)炎癥的影響[D];錦州醫(yī)科大學(xué);2019年

2 劉曼菱;豬胎兒腎臟發(fā)育階段的研究與Pax2基因敲除豬細(xì)胞系的制備[D];南京醫(yī)科大學(xué);2019年

3 肖春虹;TLR4在小鼠腸缺血再灌注損傷中的雙重作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

4 董維鵬;PLIN1基因敲除對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂解的影響及機(jī)制探究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2019年

5 戴穎欣;社區(qū)獲得性金葡菌克隆株ST398 ESS系統(tǒng)三個(gè)膜蛋白和新的分泌蛋白EsxX功能研究[D];上海交通大學(xué);2017年

6 趙宇明;利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建人MPZL1基因敲除的SPC-A1穩(wěn)定細(xì)胞株[D];吉林大學(xué);2019年

7 吳岱津;LDLR~(-/-)基因敲除兔子制備和動(dòng)脈粥樣硬化的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

8 楊宜坤;粟酒裂殖酵母鈉耐受性基因的篩選鑒定與機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

9 方斌;ApoE基因敲除巴馬豬動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立及表型分析[D];南京醫(yī)科大學(xué);2018年

10 沈梓盈;載脂蛋白E基因敲除小型豬的建立及肝臟表型分析[D];吉林大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2880013