目的探討腸道病毒71型(EV71)2A蛋白酶與宿主蛋白泛素特異性蛋白酶4(USP4)在EV71感染中的作用。方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EV71感染人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD)后USP4 mRNA表達(dá)水平,western blot檢測(cè)VP1及USP4蛋白;通過(guò)敲減宿主細(xì)胞USP4,觀察VP1 mRNA的表達(dá)和病毒滴度水平;通過(guò)過(guò)表達(dá)2A蛋白酶,研究宿主細(xì)胞USP4蛋白的切割原因。結(jié)果熒光定量PCR結(jié)果表明,EV71感染8 h時(shí)USP4 mRNA的表達(dá)水平開(kāi)始降低(0 h、8 h分別為1.03±0.04和0.83±0.02,t=4.50,P0.05);western blot結(jié)果表明,EV71感染8 h時(shí)USP4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低(0 h、8 h分別為1.25±0.01和0.51±0.02,t=57.32,P0.05)并出現(xiàn)切割條帶;敲除宿主細(xì)胞USP4 8 h后,與對(duì)照組(1.48±0.08)相比,實(shí)驗(yàn)組VP1 mRNA表達(dá)水平(3.66±0.08)明顯升高(t=17.51,P0.05);病毒滴度檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組病毒滴度[(8.20±0.17)×10~5 PFU/mL]比較,siRNA1敲除組病毒滴度[(10.55±0.29)×10~5 PFU/mL]升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.98,P0.05)。過(guò)表達(dá)2A蛋白酶,宿主蛋白USP4出現(xiàn)切割條帶。結(jié)論 USP4參與抗病毒免疫反應(yīng),可能正向調(diào)節(jié)抗病毒信號(hào)通路;EV71可通過(guò)2A蛋白酶切割宿主細(xì)胞蛋白USP4從而逃逸免疫應(yīng)答,促進(jìn)病毒的復(fù)制。
【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 抗體、病毒和細(xì)胞來(lái)源
    1.2 主要試劑與儀器
    1.3 空斑試驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度
    1.4 EV71病毒感染RD細(xì)胞
    1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
    1.6 western blot
    1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)
    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 病毒滴度的檢測(cè)
    2.2 EV71感染RD細(xì)胞后USP4的表達(dá)情況
        2.2.1 EV71感染RD細(xì)胞后USP4 mRNA表達(dá)水平
        2.2.2 EV71感染RD細(xì)胞后USP4和VP1蛋白質(zhì)表達(dá)水平
    2.3 敲減USP4后USP4、VP1 mRNA表達(dá)水平及病毒滴度變化
        2.3.1 USP4敲除后USP4 mRNA表達(dá)水平
        2.3.2 USP4 siRNA1敲除組和對(duì)照組中VP1 mRNA表達(dá)水平
        2.3.3 空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度
    2.4 EV71中的2A蛋白酶切割細(xì)胞中USP4蛋白
3 討論

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