研究背景及目的Aicardi-Goutières綜合征(Aicardi-Goutières syndrome,AGS)是一種罕見的遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,多發(fā)于新生兒,被認(rèn)為是一種自身免疫性疾病。AGS臨床表現(xiàn)為亞急性腦脊髓炎,伴有腦萎縮、顱內(nèi)鈣化、腦白質(zhì)病變、腦脊液淋巴細(xì)胞增多以及干擾素α(Interferonα,IFN-α)水平異常升高。研究發(fā)現(xiàn)SAMHD1(Sterile alpha motif domain and histidine/aspartic acid domain-containing protein1)基因發(fā)生突變可以引起AGS。2013年兩個(gè)獨(dú)立的研究小組幾乎同時(shí)建立了SAMHD1缺陷小鼠模型,發(fā)現(xiàn)SAMHD1缺陷小鼠腹腔或骨髓來源巨噬細(xì)胞中Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)上調(diào),但是其未出現(xiàn)嚴(yán)重的自身免疫病癥狀。2015年Kasher PR等建立了SAMHD1缺陷的斑馬魚模型,此模型能出現(xiàn)類似人類AGS的腦部癥狀。然而,斑馬魚不是哺乳動(dòng)物,不太適合用來研究人類AGS產(chǎn)生的分子機(jī)制和靶向治療。大鼠神經(jīng)系統(tǒng)與人類相似,SAMHD1基因缺陷大鼠很可能是研究人AGS的理想動(dòng)物模型。本研究的目的是建立SAMHD1基因敲除大鼠模型并觀察此模型是否出現(xiàn)類似人AGS的癥狀,為深入研究AGS致病機(jī)制和靶向治療奠定基礎(chǔ)。方法(1)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建SAMHD1基因敲除大鼠及PCR鑒定a)sgRNA設(shè)計(jì)及構(gòu)建:設(shè)計(jì)針對(duì)SAMHD1基因第四個(gè)外顯子的sgRNA,構(gòu)建sgRNA。b)原核注射及移植:對(duì)大鼠進(jìn)行超排卵處理;將sgRNA注射至受精卵、移植得到F0代大鼠。c)F0代大鼠鑒定及繁育:通過PCR和測(cè)序驗(yàn)證敲除(KO)陽性大鼠;將陽性F0代大鼠和SD大鼠回交。d)F1代大鼠鑒定:通過PCR和測(cè)序驗(yàn)證陽性F1大鼠。e)將F1代雜合子大鼠配籠繁育,對(duì)配繁出生的大鼠進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定,獲得SAMHD1敲除的F2代純合子大鼠。將F2代純合子大鼠配籠繁育,獲得一定數(shù)量SAMHD1敲除的純合子大鼠后開展后續(xù)研究。(2)檢測(cè)SAMHD1缺陷大鼠各器官和組織SAMHD1的表達(dá)情況蛋白質(zhì)印跡法Western Blot檢測(cè)SAMHD1在各器官和組織的表達(dá)情況。(3)SAMHD1缺陷大鼠腦部是否有病變?a)磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)檢測(cè)SAMHD1缺陷大鼠有無出現(xiàn)腦萎縮、顱內(nèi)鈣化和白質(zhì)病變。b)Morris水迷宮方法檢測(cè)SAMHD1缺陷大鼠的定位航行和空間探索能力。(4)SAMHD1缺陷大鼠是否有Ⅰ型干擾素異常升高的自身免疫病癥狀?抽取8周左右SAMHD1缺陷大鼠外周血,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)IFN-α、β水平。(5)SAMHD1缺陷大鼠哪些器官和組織Ⅰ型干擾素表達(dá)水平升高?取8周左右SAMHD1缺陷大鼠各器官和組織,免疫組化、qRT-PCR檢測(cè)各器官和組織是否高表達(dá)IFN-α、β。結(jié)果(1)PCR及測(cè)序結(jié)果顯示獲得3只KO陽性的F0代大鼠。其中24號(hào)是-184 bp敲除,25號(hào)是-346 bp敲除。(2)PCR及測(cè)序結(jié)果顯示F1代32、33號(hào)為-184 bp敲除雜合子大鼠,53、56、57號(hào)為-346 bp敲除雜合子大鼠。(3)將F1代-346 bp敲除雜合子進(jìn)行配籠繁育,共獲得F2代大鼠9只,其中純合子(SAMHD1-/-)3只(85、86、88號(hào)),雜合子(SAMHD1+/-)4只(87、89、90、91號(hào)),野生型2只(92、93號(hào))。(4)Western Blot結(jié)果顯示在SAMHD1缺陷純合子大鼠各器官和組織中,SAMHD1基因被敲除,無法正常表達(dá)。(5)磁共振成像結(jié)果顯示8周SAMHD1缺陷大鼠無明顯的腦萎縮、顱內(nèi)鈣化和白質(zhì)病變。(6)ELISA結(jié)果顯示與野生型大鼠相比較,8周SAMHD1缺陷大鼠外周血血清中,IFN-α、β水平有明顯上升。(7)免疫組化、qRT-PCR結(jié)果顯示8周SAMHD1缺陷大鼠各器官和組織高表達(dá)IFN-α、β。結(jié)論成功構(gòu)建SAMHD1敲除大鼠模型,并發(fā)現(xiàn)此模型有Aicardi-Goutieres綜合征相關(guān)的Ⅰ型干擾素高表達(dá)現(xiàn)象。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R596;R-332
【部分圖文】：

32圖 1.CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建 SAMHD1 基因敲除大鼠 A.大鼠 SAMHD1 基因結(jié)構(gòu)示意圖。展示了大鼠 SAMHD1 基因的部分片段。灰色部分為 UTR 非編碼區(qū)，橙色部分為外顯子。設(shè)計(jì)的 sgRNA 和切除位點(diǎn)就位于第四外顯子上。B.SAMHD1 第四外顯子的堿基序列。5S1、5S2、3S1、3S2 均為 sgRNA 結(jié)合作用的位置。F0-tF1、F0-tR1 和 WT-tF1、F0-tR2 為鑒定大鼠基因是否敲除的引物 C.設(shè)計(jì)的 sgRNA 的名稱及其堿基序列。

0代大鼠PCR鑒定：A.PCR電泳結(jié)果

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文NA，N為空白對(duì)照；DL2000條帶，從上到下條帶依次為2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp.B為鑒定的結(jié)果，24，25，27第四外顯子全部刪除，KO陽性。Figure2.PCR identification of F0 generation rats:A.The result of PCRelectrophoresis.SD is the negative control.it is the DNA of SD genome.N is the blankcontrol;DL2000 band,from top to bottom band,is 2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp.B.The result of identification.All the fourth exons of 24th, 25th, 27th rat aredeleted and KO is positive.AB
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本文編號(hào)：2878677