背景:氨基酸是構(gòu)成生命物質(zhì)基礎(chǔ)的基本單位。正常生理狀態(tài)下,生物體內(nèi)的氨基酸譜處于一種平衡狀態(tài),氨基酸譜的失衡是眾多疾病的誘因或表現(xiàn)形式。研究表明,氨基酸譜在健康評估、疾病診斷、療效評價等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用日益廣泛,氨基酸譜是研究重大代謝性疾病及其防控策略的重要技術(shù)手段之一。郭姣教授首次提出―糖脂代謝病‖(GLMD)創(chuàng)新理論,認(rèn)為GLMD以糖脂代謝紊亂為特征,涉及神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥和腸道菌群失調(diào)五項核心病理病機,但GLMD氨基酸譜的動態(tài)變化特征尚不明確。高脂血癥作為最常見的糖脂代謝病臨床表現(xiàn)形式,如何有效防控高脂血癥是一項重大而艱巨的任務(wù)。田黃方(THP)是郭姣教授根據(jù)長期臨床經(jīng)驗總結(jié)的代表方,對高脂血癥具有明顯療效。前期研究表明,THP除了顯著降脂之外,還參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥、氨基酸代謝、能量代謝等。然而,目前尚無基于氨基酸全譜表征高脂血癥以及THP的干預(yù)機制研究。目的:建立血漿氨基酸的定性定量分析方法,構(gòu)建高脂血癥氨基酸特征譜,基于氨基酸特征譜研究THP干預(yù)高脂血癥的作用及機制。方法:1.血漿中氨基酸的指紋圖譜研究:采用UPLC-Q/TOF MS分析技術(shù)對空白大鼠血漿氨基酸進行綜合定性分析,包括直接定性和衍生化定性;對血漿氨基酸進行AQC衍生后,優(yōu)化液相色譜和質(zhì)譜條件并進行方法學(xué)考察,建立血漿氨基酸的AQC柱前衍生結(jié)合UPLC-QDa的定量分析方法。2.高脂血癥氨基酸特征譜的構(gòu)建:分別采用高脂乳劑灌胃、20%高果糖自由飲食和高脂飼料飼喂三種方式建立高脂血癥大鼠模型,采用生化分析儀檢測血糖血脂指標(biāo)評價模型。采用已建立的方法對高脂血癥大鼠血漿氨基酸進行定量分析,結(jié)合多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)高脂血癥血漿中的氨基酸類生物標(biāo)志物,構(gòu)建高脂血癥氨基酸特征譜。進一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法分析特征氨基酸的靶點和信號通路,闡釋特征氨基酸的生物學(xué)意義。3.THP對高脂血癥特征氨基酸的干預(yù)作用:以高脂血癥小鼠血漿為研究對象,基于AQC柱前衍生結(jié)合UPLC-QDa分析技術(shù)對氨基酸進行定量分析,結(jié)合多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)氨基酸類生物標(biāo)志物,構(gòu)建高脂血癥氨基酸特征譜并研究THP對高脂血癥特征氨基酸的干預(yù)作用。結(jié)果:1.血漿氨基酸的指紋圖譜研究綜合采用直接和衍生化分析方法,空白大鼠血漿中共鑒定出52種氨基酸。采用AQC柱前衍生結(jié)合UPLC-QDa分析技術(shù),在10.7 min內(nèi)可同時定量分析36種氨基酸。2.高脂血癥氨基酸特征譜的構(gòu)建采用高脂乳劑灌胃、20%高果糖自由飲食和高脂飼料飼喂三種方式建立了高脂血癥大鼠模型,血糖血脂指標(biāo)及氨基酸均出現(xiàn)代謝紊亂。血漿氨基酸譜可有效判別正常組和高脂血癥模型組大鼠,所構(gòu)建的高脂血癥氨基酸特征譜共計20個氨基酸,包括Glu、Sar、β-AIB、Cys2和Pip 5個共同氨基酸,其變化趨勢是Glu和Sar均出現(xiàn)降低,β-AIB、Pip和Cys2升高或降低。以上高脂血癥特征氨基酸存在3個共同靶點,即PTGS1、PYGM和PTGS2,預(yù)測參與調(diào)節(jié)脂肪細胞中的脂肪分解、淀粉和蔗糖代謝、胰島素抵抗等信號通路。3.THP對高脂血癥特征氨基酸的干預(yù)作用高脂血癥小鼠血漿氨基酸譜共計13個氨基酸,包括Pip、Ser、Ala、Met、Aad、β-AIB、Car和Asn,其變化規(guī)律是Pip、Ser、Ala、Met、Aad、β-AIB、Car和Asn水平升高,而Sar、Phe、Ile、Orn和Val水平降低。在藥物作用上,THP對血漿Sar、Aad、β-AIB和Car具有調(diào)節(jié)作用。與阿托伐他汀相比,THP可獨特調(diào)節(jié)Sar,預(yù)測作用于PPIG和GNMT高脂血癥靶點,參與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路。結(jié)論:本研究鑒定出了大鼠血漿中的52種氨基酸,建立了10.7 min內(nèi)同時定量36種氨基酸的AQC柱前衍生UPLC-QDa分析方法。高脂乳劑灌胃、20%果糖飲食和高脂飼料飼喂三種方式下的大鼠高脂血癥血漿中氨基酸代謝出現(xiàn)紊亂,氨基酸譜可用于表征高脂血癥。在干預(yù)作用方面,血漿氨基酸譜也可用于表征THP給藥后小鼠體內(nèi)代謝改變。與阿托伐他汀相比,THP可獨特調(diào)節(jié)血漿Sar,預(yù)測其作用于PPIG和GNMT高脂血癥靶點,參與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R589.2;R-332
【部分圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文1.1.2 氨基酸及其生物學(xué)意義概述氨基酸是構(gòu)成生命物質(zhì)基礎(chǔ)的基本單位，參與調(diào)節(jié)機體的生理功能并類、脂肪、核苷酸等密切相關(guān)。目前，自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸有 300 多種常見的 20 種蛋白質(zhì)氨基酸外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其他一些氨基酸不僅為基因表達和蛋白磷酸化級聯(lián)的調(diào)節(jié)因子，而且也是合成激素和低分子量物質(zhì)的關(guān)鍵前體，具有重要的生物學(xué)意義[10-11]。

圖 1-2 技術(shù)路線圖1.6 研究意義與創(chuàng)新性1.6.1 研究意義（1）完善 GLMD 的生物標(biāo)志物體系，為 GLMD 創(chuàng)新理論提供進一步的支持；（2）為高脂血癥發(fā)病機制及降脂中藥研發(fā)提供思路。1.6.2 創(chuàng)新性（1）首次將氨基酸譜作為表征不同誘因下的高脂血癥以及 THP 給藥前后代謝改變的一種新策略；（2）結(jié)合氨基酸分析與網(wǎng)絡(luò)分析探索氨基酸在高脂血癥中的生物學(xué)意義。

圖 2-1 37 種氨基酸混標(biāo)溶液（a）和血漿樣品（b）TIC 圖.4 討論為最大化提取血漿中的氨基酸，首先對樣品前處理方法進行選擇。據(jù)道，血漿樣品中氨基酸提取方法以酸提取、有機溶劑提取等方法為主，除蛋白質(zhì)，防止其阻塞色譜柱引起流速下降且不穩(wěn)定而影響分離效果。楊酸是提取血漿中氨基酸最普遍的方法，濃度 5-20%不等[59-60]，與樣品比例混合離心去除蛋白，也常用如甲醇、乙腈或提取緩沖液使樣品中的變性，然后高速離心達到徹底去除樣品中的蛋白質(zhì)[15, 61]。本節(jié)采用 20%水楊酸、5%的磺基水楊酸、乙腈、提取緩沖液等試劑進行氨基酸的提取采用 LC-MS 檢測，以氨基酸種類和質(zhì)譜響應(yīng)為評判標(biāo)準(zhǔn)，最終選擇以 磺基水楊酸為提取溶劑。其次，對氨基酸的色譜、質(zhì)譜條件進行優(yōu)化選
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本文編號：2876047