背景剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種寄生于人和動(dòng)物有核細(xì)胞內(nèi)的原蟲,近年來研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染會(huì)導(dǎo)致宿主腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、顫蛋白(Reelin)和谷氨酸脫羧酶67(GAD67)等蛋白的表達(dá)異常,從而影響宿主腦認(rèn)知功能,此外,還與精神障礙及行為、性格發(fā)生改變相關(guān)。也有研究表示弓形蟲感染能改變動(dòng)物性激素水平,而性激素與BDNF、Reelin和GAD67等蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。因此,為了詳細(xì)探討性激素異常與感染弓形蟲疊加后對腦認(rèn)知功能的影響。我們分別摘除雌、雄小鼠雙側(cè)卵巢和睪丸,建立去勢動(dòng)物模型(模擬性激素下降或缺失人群),研究性激素下降或缺失狀態(tài)下感染弓形蟲后腦內(nèi)BDNF、Reelin和GAD67等與學(xué)習(xí)、記憶、行為相關(guān)分子的表達(dá)狀況,。目的探討去勢小鼠感染弓形蟲后腦內(nèi)BDNF、Reelin及GAD67等相關(guān)分子的表達(dá)情況。方法選用10周齡的NIH小鼠80只(雄小鼠40只,雌小鼠40只),將雌性小鼠隨機(jī)分為正常對照組(F1,10只),去勢組(F2,10只),弓形蟲感染組(F3,10只),去勢+弓形蟲感染組(F4,10只);雄性小鼠分為正常對照組(M1,10只),去勢組(M2,10只),弓形蟲感染組(M3,10只),去勢+弓形蟲感染組(M4,10只)。無菌手術(shù)摘除雌性小鼠雙側(cè)卵巢和雄性小鼠雙側(cè)睪丸,角細(xì)胞涂片及血清雌激素水平驗(yàn)證雌性小鼠去勢效果;肉眼觀測及血清雄激素水平驗(yàn)證雄性小鼠去勢效果。1周以后對F3、M3、F4、M4組每只小鼠以灌胃方式感染弓形蟲PRU株包囊4-5個(gè),60天后采用抗弓形蟲IgG抗體ELISA試劑盒對其血清進(jìn)行弓形蟲特異性IgG抗體的檢測。Morris水迷宮定位定航與空間探索實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力的改變。采用ELISA試劑盒定量檢測小鼠外周血雌二醇、睪酮和腦組織中BDNF、Reelin和GAD67的蛋白表達(dá)水平,提取小鼠腦組織RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用real-time PCR方法檢測BDNF IV、BDNF IX、BDNF T、Reelin和GAD67的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果1、60天后感染組和去勢+感染組小鼠的弓形蟲特異性IgG抗體檢測結(jié)果為:感染陽性率為100%,確認(rèn)弓形蟲感染成功。2、Morris水迷宮和性激素檢測結(jié)果:雌性小鼠平均逃避潛伏期去勢組連續(xù)五天長于正常對照組(P0.05),感染組第一、第二天無明顯差異(P0.05),第三、第四、第五天短于正常對照組(P0.05),去勢+感染組短于去勢組(P0.05),外周血雌二醇水平去勢組低于正常對照組(P0.05),感染組高于正常對照組(P0.05),去勢+感染組高于去勢組(P0.05);雄性小鼠平均逃避潛伏期去勢組連續(xù)五天長于正常對照組(P0.05),感染組短于正常對照組(P0.05),去勢+感染組小鼠長于去勢組(P0.05),睪酮水平去勢組低于正常對照組(P0.05),感染組高于正常對照組(P0.05),去勢+感染組高于去勢組(P0.05)。3、腦組織BDNF、Reelin、GAD67蛋白及其mRNA表達(dá)結(jié)果為:雌性小鼠BDNF去勢組與正常對照組差異不顯著(P0.05),感染組高于正常對照組(P0.05),去勢+感染組高于去勢組(P0.05);BDNF IVmRNA表達(dá)去勢組高于正常對照組(P0.05),感染組低于正常對照組(P0.05),去勢+感染組低于去勢組(P0.05);BDNF IX mRNA表達(dá)去勢組低于正常對照組(P0.05),感染組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),去勢+感染組與去勢組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);BDNF T mRNA表達(dá)去勢組低于正常對照組(P0.05),感染組低于正常對照組(P0.05),去勢+感染組低于去勢組(P0.05);Reelin蛋白去勢組與正常對照組差異不顯著(P0.05),感染組高于正常對照組(P0.05),去勢+感染組和去勢組差異不顯著(P0.05);Reelin mRNA表達(dá)去勢組低于正常對照組(P0.05),感染組低于正常對照組(P0.05),去勢+感染組低于去勢組(P0.05);GAD67去勢組低于正常對照組(P0.05),感染組與正常對照組差異不顯著(P0.05),去勢+感染組與去勢組差異不顯著(P0.05);GAD67 mRNA表達(dá)去勢組低于正常對照組(P0.05),感染組高于正常對照組(P0.05),去勢+感染組低于去勢組(P0.05)。4、雄性小鼠結(jié)果:BDNF去勢組與正常對照組差異不顯著(P0.05),感染組高于正常對照組(P0.05),去勢+感染組高于去勢組(P0.05);BDNF IV mRNA表達(dá)去勢組高于正常對照組(P0.05),感染組和正常對照組差異不顯著(P0.05),去勢+感染組低于去勢組(P0.05);BDNF IX mRNA表達(dá)去勢組高于正常對照組(P0.05),感染組低于正常對照組(P0.05),去勢+感染組低于去勢組(P0.05);BDNF T mRNA表達(dá)去勢組低于正常對照組(P0.05),感染組低于正常對照組(P0.05),去勢+感染組高于去勢組(P0.05);Reelin蛋白去勢組與正常對照組差異不顯著(P0.05),感染組高于正常對照組(P0.05),去勢+感染組高于去勢組(P0.05);Reelin mRNA表達(dá)去勢組低于正常對照組(P0.05),感染組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),去勢+感染組高于去勢組(P0.05);GAD67去勢組低于正常對照組(P0.05),感染組高于正常對照組(P0.05),去勢+感染組高于去勢組(P0.05);GAD67 mRNA表達(dá)去勢組高于正常對照組(P0.05),感染組低于正常對照組(P0.05),去勢+感染組低于去勢組(P0.05)。結(jié)論性激素水平下降或缺失情況下感染弓形蟲后,雌、雄性小鼠外周血性激素水平異常升高,雌性小鼠空間記憶能力升高,雄性小鼠空間記憶能力下降;雌、雄小鼠腦部海馬組織BDNF、Reelin、GAD67蛋白及其mRNA表達(dá)異常改變。此外,這些蛋白因子在雌性和雄性小鼠表達(dá)和分布方面存在一定的差異。
【學(xué)位單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R382.5
【部分圖文】：

圖 2-1 SYBR Green I 染料工作原理圖研究表明，每個(gè)樣品的 CT值（C 代表 Cycle，T 代表 threshold，CT值指樣品管的熒光信號達(dá)到某一固定閾值的 PCR 反應(yīng)循環(huán)數(shù)）與該樣品模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。兩者關(guān)系可用一公式表示：CT=-klogX0+b�！� △ CT相對定量法就是首先計(jì)算目的基因 CT值與管家基因 CT值之差△ CT，然后根據(jù)公式△ △ CT= △CTUnknown（處理后樣本△ CT 值）-△ CTCalibrator（校準(zhǔn)樣本△ CT 值）計(jì)算獲得 2-△ △ CT，從而獲得目的基因在處理后相對于校準(zhǔn)組基因的倍數(shù)關(guān)系。2.7.5 引物序列引物由上海生工生物工程有限公司合成，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GADPH）為反應(yīng)體系內(nèi)參照，進(jìn)行相對定量 PCR。引物序列見表 2-1。

去勢手術(shù)前陰道角細(xì)胞涂片（放大倍數(shù)400×）

取 F2、F4 組的小鼠，在動(dòng)情間期連續(xù)五天做的，去勢手術(shù) 1 周后，再連續(xù)五天的陰道角細(xì)胞涂片無角細(xì)胞去勢手術(shù)是否成功。圖 3-1 去勢手術(shù)前陰道角細(xì)胞涂片（放大倍數(shù) 400×）
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