目的研制一種可同時(shí)預(yù)防棘球蚴病與狂犬病的重組活載體疫苗。方法利用反向遺傳技術(shù),將細(xì)粒棘球蚴Eg95基因ORF區(qū)插入狂犬病病毒弱毒SAD株基因組的假基因區(qū),得到全長(zhǎng)感染性克隆,與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,拯救獲得重組狂犬病病毒SAD-EG95株。結(jié)果重組病毒SAD-EG95株經(jīng)RT-PCR與免疫熒光鑒定,表明重組病毒基因組中包含細(xì)粒棘球蚴Eg95基因,且能表達(dá)EG95蛋白。該重組病毒能在BHK-21和NA細(xì)胞中復(fù)制,病毒生長(zhǎng)曲線與親本株SAD差異較小,且傳代穩(wěn)定性良好,能在小鼠模型中誘導(dǎo)產(chǎn)生狂犬病病毒和細(xì)粒棘球蚴特異性保護(hù)抗體。結(jié)論成功構(gòu)建表達(dá)細(xì)粒棘球蚴EG95蛋白的重組狂犬病病毒,為進(jìn)一步研制預(yù)防狂犬病和細(xì)粒棘球蚴的二聯(lián)疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【部分圖文】：

在小鼠體內(nèi)進(jìn)行初步免疫評(píng)價(jià)，免疫SAD株和SAD-EG95株4周后，經(jīng)FAVN法檢測(cè)小鼠血清中RABV中和抗體水平。親本SAD組和重組SAD-EG95組的血清內(nèi)均可檢測(cè)到抗RABV中和抗體，SAD組中和抗體效價(jià)約為2.08 IU/ml,SAD-EG95組效價(jià)約為6.37 IU/ml，均高于WHO認(rèn)定的具有有效保護(hù)能力的抗體水平（0.5 IU/ml）。SAD-EG95組小鼠血清抗體滴度略高于SAD組小鼠，表明重組病毒具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生RABV中和抗體的能力（圖6A）。2.7 ELISA法檢測(cè)EG95特異性抗體

對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行Pfl23Ⅱ和NheⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳觀察經(jīng)酶切后陽(yáng)性質(zhì)粒出現(xiàn)兩條帶，分別與預(yù)測(cè)的載體pSAD質(zhì)粒全長(zhǎng)基因片段（17 kb）和細(xì)粒棘球蚴Eg95基因片段（471 bp）大小相符（圖1），結(jié)果表明含有Eg95基因的重組全長(zhǎng)感染性克隆pSAD-EG95構(gòu)建成功。2.2重組病毒的IFA鑒定

提取SAD和SAD-EG95病毒的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后以特異性引物SADInsert進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，SAD樣本僅擴(kuò)增出假基因區(qū)，而重組病毒SAD-EG95樣本擴(kuò)增出目的條帶約為800 bp（圖3）。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，重組病毒成功插入外源基因Eg95。圖3 SSAADD‐‐EEGG95 RRTT‐‐PPCCRR鑒定
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