目的:布魯斯菌(Brucella)是引起布魯斯菌病(Brucellosis)的病原體。布魯斯菌病可以引起人類的波狀熱,牛、羊、豬等家畜的流產(chǎn)。布魯斯菌可分為六個種,即馬耳他布魯斯菌、流產(chǎn)布魯斯菌、豬布魯斯菌、綿羊布魯斯菌、犬布魯斯菌和沙林鼠布魯斯菌。布魯斯菌病是世界范圍內(nèi)較嚴重的人畜共患傳染病之一,在我國北方地區(qū)內(nèi)蒙古、山西、吉林、黑龍江、河北、寧夏等省區(qū)流行較廣,布魯斯菌病已經(jīng)成為最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。目前,對動物布魯斯菌病的防治,依據(jù)各地區(qū)實際狀況的不同,主要是采用疫苗免疫接種或檢疫、撲殺的方法。迄今為止已有幾種較成功的布魯斯菌減毒疫苗應(yīng)用于生產(chǎn),國外使用的主要有牛種布魯斯菌19(B.abortus strain 19,S19)疫苗、羊種布魯斯菌Rev.1(B.melitensis Rev.1)疫苗、牛種布魯斯菌45/20(B.abortus strain 45/20)疫苗和粗糙型牛種布魯斯菌51(Rough strain B.abortus 51,RB51)疫苗。我國主要使用的是豬種布魯斯菌S2(B.suis strain2,S2)疫苗。雖然這些減毒疫苗在布魯斯菌病的防治上起到了積極的作用,但它們有的毒力較強,在推薦劑量使用時對于妊娠動物還存在流產(chǎn)的可能,對人類來說并不安全,存在著潛在感染人類的可能性,有的免疫保護率低,不能供人類應(yīng)用。因此有必要研制和開發(fā)新型布魯斯菌疫苗。因為布魯斯菌是一種可以在細胞內(nèi)寄生并造成感染的病原微生物,因此可以引起機體強烈的細胞免疫應(yīng)答,在對抗細胞內(nèi)寄生菌感染方面極具潛力的核酸疫苗就成為了人們關(guān)注的研究熱點。核酸疫苗與常規(guī)疫苗相比除了在預(yù)防細胞內(nèi)寄生菌感染方面效果較好外,還具有無感染風(fēng)險、可激發(fā)長期的免疫應(yīng)答、比減毒疫苗具有更高的穩(wěn)定性并且易于制備、造價低等優(yōu)點�，F(xiàn)在已有核酸疫苗用于預(yù)防人和動物的多種病毒、真菌和寄生蟲感染的報道。在布魯斯菌核酸疫苗的研究報道中,除了用布魯斯菌外膜蛋白基因構(gòu)建的核酸疫苗外,還有一些用布魯斯菌胞內(nèi)蛋白基因構(gòu)建核酸疫苗的報道。據(jù)報道,布魯斯菌胞內(nèi)蛋白如:L7/L12核糖體蛋白、Cu/Zn超氧化物歧化酶等基因皆可作為布魯斯菌核酸疫苗的候選基因并取得了較好的免疫效果。這說明,布魯斯菌的胞內(nèi)蛋白基因也可以作為核酸疫苗的候選基因。布魯斯菌BvrR/BvrS雙組分系統(tǒng)是調(diào)節(jié)布魯斯菌感知系統(tǒng)的蛋白,在不同種屬的布魯斯菌中具有很高的同源性。據(jù)報道,布魯斯菌BvrR/BvrS缺失突變株表現(xiàn)出侵入細胞的能力減弱,不能抵抗溶酶體的消化作用,在細胞內(nèi)的復(fù)制能力也減弱。更進一步的研究還發(fā)現(xiàn),BvrR/BvrS的缺失使布魯斯菌失掉對細胞殺菌多聚陽離子的抵抗作用,可增加布魯斯菌細胞膜表面對表面活性劑的通透性。因此,BvrR/BvrS雙組分系統(tǒng)與布魯斯菌的毒力有關(guān)。鑒于該組蛋白在細胞內(nèi)較保守不宜變異,不同種屬的布魯斯菌BvrR/BvrS基因具有高度同源性,如果該調(diào)節(jié)蛋白具有特異的免疫原性則可作為布魯斯菌的核酸疫苗,使用這一種疫苗可預(yù)防多種屬布魯斯菌的感染,在布魯斯菌病的特異性預(yù)防領(lǐng)域會有重要意義。本研究擬采用布魯斯菌BvrR/BvrS雙組分系統(tǒng)中的BvrR基因作為靶基因,插入真核表達載體pcDNA3.1中構(gòu)建新型核酸疫苗pcDNA-BvrR,然后轉(zhuǎn)染Vero細胞分析其在細胞內(nèi)的瞬時表達情況。隨后將重組真核表達質(zhì)粒pcDNA-BvrR免疫BALB/c小鼠來探討B(tài)vrR基因核酸疫苗的免疫效果。這些研究為進一步探討布魯斯菌BvrR基因核酸疫苗的免疫機理以及保護效果提供依據(jù)。利用BvrR基因在布魯斯菌種屬之間具有高度同源性的特點,用一種核酸疫苗將可以預(yù)防多種屬布魯斯菌的感染。研究方法:1、BvrR基因的PCR擴增。獲取PCR擴增模板,20μL反應(yīng)體系中用引物P1、P2進行PCR擴增。反應(yīng)結(jié)束后取10μL反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳,觀察電泳結(jié)果。2、原核表達載體pET28a-BvrR的構(gòu)建。BvrR基因與載體pET-28a連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞,提取重組質(zhì)粒pET28a-BvrR。3、原核表達載體pET28a-BvrR表達產(chǎn)物的Western blotting分析。轉(zhuǎn)印后用封閉液浸泡轉(zhuǎn)印膜,室溫封閉1-2h,一抗室溫孵育,二抗室溫孵育,DAB顯色。4、真核表達載體pcDNA-BvrR的構(gòu)建。BvrR基因與載體pcDNA連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,提取重組質(zhì)粒pcDNA-BvrR。5、真核表達載體pcDNA-BvrR表達產(chǎn)物的RT-PCR及Western blotting分析。使用Simply P總RNA提取試劑盒提取總RNA,采用兩步法試劑盒(寶生物公司)進行RT-PCR,按照廠家推薦步驟進行,以引物P2為特異引物進行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)結(jié)束后取10μL反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳,觀察電泳結(jié)果。制備凝膠板,進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳,根據(jù)凝膠面積按1-2 mA/cm~2,接通電源進行轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印后用封閉液浸泡轉(zhuǎn)印膜,室溫封閉1-2h,一抗室溫孵育,二抗室溫孵育,DAB顯色。6、pcDNA-BvrR核酸疫苗免疫BALB/c小鼠。pcDNA-BvrR免疫組、pcDNA3.1對照組分別于后肢腿部脛前肌注射濃度為1μg/μL的pcDNA-BvrR質(zhì)粒和pcDNA3.1質(zhì)粒,每只小鼠注射100μg質(zhì)粒。PBS對照組注射PBS 100μL間隔2周后再次注射,共免疫3次。7、ELISA方法檢測小鼠血清特異性抗體及細胞因子。采用ELISA方法檢測小鼠血清中特異性抗體及抗體亞類IgG1和IgG2a的水平,檢測小鼠血清中IFN-?、IL-4的含量,以確定pcDNA-BvrR核酸疫苗的免疫效果。8、MTT法檢測小鼠脾臟淋巴細胞增殖。9、流式細胞儀檢測小鼠T細胞亞類(CD4~+、CD8~+)。10、攻毒保護試驗確定疫苗保護率。將第3次免疫后一周的pcDNA-BvrR免疫組、pcDNA對照組小鼠后肢脛前肌注射100μL濃度為2×10~6活菌/μL的布魯斯菌S19株。在注射布魯斯菌S19株后第14天后進行無菌取脾臟,平皿中放2ml滅菌生理鹽水,將脾臟研磨均勻,接種到布魯斯菌選擇性培養(yǎng)基,37℃,5%CO_2培養(yǎng),計算菌落數(shù)。結(jié)果:1、采用PCR方法擴增了BvrR基因。2、構(gòu)建了原核表達載體pET28a-BvrR,表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測及Western blotting分析為BvrR融合蛋白。純化的BvrR蛋白與布魯斯菌多克隆抗體之間具有免疫反應(yīng)性。3、構(gòu)建了真核表達載體pcDNA-BvrR,經(jīng)RT-PCR及Western blotting鑒定,真核表達載體pcDNA-BvrR可以在真核細胞中表達。4、布魯斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以刺激小鼠產(chǎn)生特異性IgG抗體。5、布魯斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以增強小鼠IFN-?的分泌,刺激小鼠淋巴細胞的增殖,使脾細胞中CD4~+和CD8~+T細胞亞類數(shù)量顯著增多。6、布魯斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR激發(fā)機體的免疫應(yīng)答以Th-1型免疫應(yīng)答為主。結(jié)論:1、原核表達的BvrR蛋白與布魯斯菌多克隆抗體之間具有免疫反應(yīng)性。2、布魯斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以刺激小鼠產(chǎn)生特異性IgG抗體,激發(fā)機體的免疫應(yīng)答以Th-1型免疫應(yīng)答為主。3、布魯斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR產(chǎn)生了一定的免疫保護性。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達 IPTG 誘導(dǎo)、表達的含有 pET28a-BvrR 質(zhì)處理后進行 SDS-PAGE 電泳。結(jié)果如圖 預(yù)期大小相符，證明了 BvrR 融合蛋白在大

圖 4 BvrR 融合蛋白 western blotring 檢圖中 1 代表蛋白質(zhì)預(yù)染 Marker，2 代表誘導(dǎo)表達的 BvrR 融合蛋pET28a-BvrR 轉(zhuǎn)化大腸桿菌對照。3.6 純化的 BvrR 蛋白與布魯斯菌多克隆抗體免疫western blotting 對純化的 BvrR 蛋白進行檢測，通過多克隆抗體及相應(yīng)二抗孵育，DAB 顯色結(jié)果如圖 5 所示：異性條帶與預(yù)期大小相符，證明了純化的 BvrR 蛋白與布具有免疫反應(yīng)性。

純化的BvrR蛋白與布魯斯菌多克隆抗體免疫反應(yīng)性檢測結(jié)果
【參考文獻】

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本文編號：2873507