目的:分離純化和增殖培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,收集無(wú)動(dòng)物源性干細(xì)胞分泌因子制備成脂質(zhì)體囊泡,觀察脂質(zhì)體的形態(tài)與粒徑分布,通過(guò)細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)作用和生物安全性,為創(chuàng)傷治療提供新型干細(xì)胞基質(zhì)制劑并對(duì)其作用機(jī)理和安全性進(jìn)行初步的探討和評(píng)估。方法:1.臍帶組織貼壁法分離純化和傳代培養(yǎng)hUC-MSC,觀察其形態(tài),并對(duì)其表面標(biāo)記物和成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化能力進(jìn)行檢測(cè)。2.收集無(wú)動(dòng)物源性hUC-MSC分泌因子(條件培養(yǎng)液),通過(guò)ELISA法對(duì)收集的條件培養(yǎng)基進(jìn)行VEGF、IL-8、MCP-1因子的定量測(cè)定。3.用薄膜分散法制備hUC-MSC因子脂質(zhì)體囊泡,對(duì)其進(jìn)行電鏡下超微形態(tài)的觀察和粒徑分布特征的測(cè)定。4.通過(guò)與人原代真皮成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的方法,觀察hUC-MSC分泌因子對(duì)人原代真皮成纖維細(xì)胞的膠原蛋白I表達(dá)量的影響。5.通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察hUC-MSC條件培養(yǎng)液及其脂質(zhì)體對(duì)大鼠皮膚缺損模型的創(chuàng)傷修復(fù)作用,進(jìn)一步對(duì)其有效性、作用機(jī)理和安全性進(jìn)行探討和評(píng)估。結(jié)果:1.光鏡下,hUC-MSC呈大小形態(tài)均一的長(zhǎng)梭型旋渦狀,流式細(xì)胞儀檢測(cè)hUC-MSC陽(yáng)性標(biāo)志物CD29、CD44、105的表達(dá)率均≥95%,陰性標(biāo)志物CD34、CD45的表達(dá)率≤5%,且hUC-MSC可被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞。2.hUC-MSC條件培養(yǎng)液中含有干細(xì)胞分泌因子,在P5代時(shí),蛋白濃度為0.145mg/m L,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色有蛋白條帶出現(xiàn),經(jīng)ELISA測(cè)定,條件培養(yǎng)液中VEGF、IL-8、MCP-1的濃度分別為558.60 pg/m L、5236.48pg/m L、2972.55pg/m L;而空白培養(yǎng)基中,蛋白含量為0.002 mg/m L,因子VEGF、IL-8、MCP-1的濃度分別為0.000 pg/m L、0.000pg/m L、0.000pg/m L。3.用薄膜分散法制備得到hUC-MSC分泌因子脂質(zhì)體,其粒徑呈擬正態(tài)分布,粒徑范圍在37.84nm~3580.00nm,平均粒徑為262.3nm;電鏡下,hUC-MSC分泌因子脂質(zhì)體呈不規(guī)則的圓球狀,大小不均一,但分散比較均勻。4.通過(guò)與人原代真皮成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),觀察發(fā)現(xiàn)hUC-MSC分泌因子可促進(jìn)人原代真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)I型膠原蛋白。5.大鼠皮膚創(chuàng)口修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明,hUC-MSC條件培養(yǎng)基液和其脂質(zhì)體制劑均可以促進(jìn)創(chuàng)傷的修復(fù),創(chuàng)口及周邊組織石蠟切片HE染色后,光鏡下觀察可見:空白對(duì)照組與空白脂質(zhì)體對(duì)照組,創(chuàng)面修復(fù)緩慢,真皮層及創(chuàng)面深層未見腺體和毛囊生成,有組織水腫;干細(xì)胞分泌因子組,早期大鼠皮膚創(chuàng)面有肉芽組織生成,大鼠皮膚表皮層加厚,真皮層創(chuàng)面肉芽組織增加,有大量新生血管,創(chuàng)面下腺體與毛囊增多;hUC-MSC分泌因子脂質(zhì)體組,早期大鼠皮膚創(chuàng)面有肉芽組織生成,表皮層加厚大鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織增加,有大量新生血管生成,創(chuàng)面下及皮膚深層的腺體與毛囊增多。結(jié)論:1.貼壁培養(yǎng)法可獲得高純度且形態(tài)均一的hUC-MSC。2.可用無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得無(wú)動(dòng)物源性的干細(xì)胞分泌因子(條件培養(yǎng)基)。3.干細(xì)胞分泌因子可以促進(jìn)人原代真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原蛋。4.干細(xì)胞分泌因子及其脂質(zhì)體囊泡均可促進(jìn)大鼠皮膚缺損的創(chuàng)傷修復(fù)。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2 結(jié) 果2.1 hUC-MSCs 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果自組織塊接種培養(yǎng)第二周時(shí)，可在倒置顯微鏡下觀察到一些零星的、狀的細(xì)胞從組織塊周圍爬出，細(xì)胞形態(tài)大小不規(guī)則。隨著細(xì)胞的緩慢增殖由短梭形態(tài)演變成長(zhǎng)梭形態(tài)，并逐漸形成旋渦狀的細(xì)胞集群。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后進(jìn)行傳代，隨著傳代次數(shù)的增加，在倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞呈大小形態(tài)均一，細(xì)胞群緊密排列，呈現(xiàn)旋渦狀或平行狀生長(zhǎng)（圖 1-1）。

.3 hUC-MSCs 的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的 P3 代 hUC-MSCs，與對(duì)照組相比，生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)的第 8-10d，其形態(tài)發(fā)生改變且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)重疊生長(zhǎng)。在成誘導(dǎo) 28d 后，經(jīng)茜素紅染色，在顯微鏡下觀察可見茜素紅染色呈陽(yáng)性，對(duì)照組染色呈陰性（圖 1-3）。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所提取的 hUC-MSCs 可被誘導(dǎo)分化胞。圖 1-2 P3 代 hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白檢測(cè)結(jié)果A.hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白 CD105 的表達(dá); B.hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白 CD44 的表達(dá);C.hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白 CD29 的表達(dá); D.hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白 CD45 的表達(dá);E.hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白 CD34 的表達(dá)

2.3 hUC-MSCs 的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的 P3 代 hUC-MSCs，與對(duì)照組相比，生長(zhǎng)緩慢，在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第 8-10d，其形態(tài)發(fā)生改變且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)重疊生長(zhǎng)。在成骨細(xì)胞誘導(dǎo) 28d 后，經(jīng)茜素紅染色，在顯微鏡下觀察可見茜素紅染色呈陽(yáng)性，對(duì)照組茜素紅染色呈陰性（圖 1-3）。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所提取的 hUC-MSCs 可被誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞。圖 1-2 P3 代 hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白檢測(cè)結(jié)果A.hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白 CD105 的表達(dá); B.hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白 CD44 的表達(dá);C.hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白 CD29 的表達(dá); D.hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白 CD45 的表達(dá);E.hUC-MSCs 表面標(biāo)志蛋白 CD34 的表達(dá)
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張水華;李云富;王妍;;脂質(zhì)體包裹蛋白質(zhì)藥物的制備及影響因素的控制[J];藥學(xué)進(jìn)展;2006年01期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王黎明;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分泌蛋白表達(dá)譜研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2872532