傳統(tǒng)流感疫苗采用雞胚作為病毒培養(yǎng)基質(zhì),生產(chǎn)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、培養(yǎng)的病毒易突變。細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)的流感疫苗免疫原性更接近原始病毒,有望替代雞胚成為新型流感疫苗生產(chǎn)基質(zhì)。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MDCK細(xì)胞生產(chǎn)的流感疫苗在安全性和耐受性方面均優(yōu)于雞胚疫苗,但MDCK細(xì)胞具有貼壁依賴性,不利于大規(guī)模生產(chǎn),且細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要的血清具有批次不穩(wěn)定、成分不清晰等缺點(diǎn),使用能在無血清培養(yǎng)基中增殖的懸浮細(xì)胞生產(chǎn)生物制品是未來的總體趨勢(shì)。研究表明,siat7e基因可有效降低細(xì)胞貼壁性能,本研究采用基因工程技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)siat7e基因的MDCK單克隆細(xì)胞,并在無血清培養(yǎng)基中馴化為懸浮的單細(xì)胞MDCK-5G7-S,H3N2疫苗株在該細(xì)胞中增殖明顯高于貼壁細(xì)胞,為懸浮MDCK細(xì)胞用于大規(guī)模流感疫苗生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。在第一部分中,獲得了穩(wěn)定表達(dá)siat7e基因的MDCK細(xì)胞。首先構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.1-siat7e/Zeocin,通過電轉(zhuǎn)將其轉(zhuǎn)入MDCK細(xì)胞,利用博來霉素抗性篩選結(jié)合有限稀釋法得到單克隆細(xì)胞。然后通過RT-PCR和WB方法分別從mRNA水平和蛋白水平鑒定siat7e基因表達(dá)情況,并通過qRT-PCR方法分析siat7e基因相對(duì)表達(dá)量,得到穩(wěn)定高表達(dá)siat7e基因的MDCK-5G7細(xì)胞。在第二部分中,對(duì)MDCK-5G7細(xì)胞進(jìn)行懸浮馴化并進(jìn)行功能研究。首先對(duì)OptiPRO SFM、FreeStyle 293、CD293和VirusPro MDCK-S 4種無血清培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,選擇可使MDCK-5G7細(xì)胞迅速適應(yīng)的VirusPro MDCK-S培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮馴化,獲得在VirusPro MDCK-S無血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞MDCK-5G7-S。對(duì)細(xì)胞起始接種密度進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳接種密度為1×10~6cells/mL,96h達(dá)到最高細(xì)胞密度2.45×10~6 cells/mL,存活率維持在80%以上。選擇疫苗株A/Switzerland/9715293/2013(H3N2)按感染復(fù)數(shù)為0.1分別接種貼壁MDCK、貼壁MDCK-5G7、懸浮MDCK-S和懸浮MDCK-5G7-S細(xì)胞,收集12h、24h、48h、72h和96h的病毒并測(cè)定CCID_(50)滴度,繪制病毒生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)病毒在4種培養(yǎng)基中增殖趨勢(shì)一致。比較48h病毒滴度,懸浮細(xì)胞的病毒產(chǎn)量均高于貼壁細(xì)胞,siat7e基因的轉(zhuǎn)入進(jìn)一步提高了病毒滴度,其中MDCK-5G7-S病毒滴度CCID_(50)可達(dá)10~(7.9)/mL,為流感病毒研究提供新的思路。
【學(xué)位單位】：中國(guó)食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

苗最理想的細(xì)胞基質(zhì)。MDCK 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可以提高細(xì)胞密度和抗原短時(shí)間內(nèi)快速生產(chǎn)大量流感疫苗，降低生產(chǎn)成本。目前多項(xiàng)研究表明 sia以降低 MDCK 細(xì)胞的貼壁依賴程度，使馴化過程更為方便快捷。了獲得可懸浮生長(zhǎng)的 MDCK 細(xì)胞，本研究通過電轉(zhuǎn)將構(gòu)建的 pcDNA3/Zeocin 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 MDCK 細(xì)胞，通過抗生素篩選結(jié)合有限稀釋法得到穩(wěn)siat7e 基因的陽(yáng)性克隆。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄 PCR 和蛋白免疫印跡方法分別從轉(zhuǎn)錄白質(zhì)表達(dá)水平驗(yàn)證 siat7e 基因表達(dá)情況，為下一步懸浮馴化奠定基礎(chǔ)。驗(yàn)材料體、菌株和細(xì)胞體：pcDNA3.1/Zeocin 真核表達(dá)載體，購(gòu)自 Invitrogen 公司，載體圖譜；

中國(guó)食品藥品檢定研究院碩士學(xué)位論文載體 pcDNA3.1/Zeocin 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α。 經(jīng)酶A3.1-siat7e/Zeocin 載體。圖 1.2 顯示泳道 2、4、6 均可在觀察到線性化載體和 siat7e 基因片段，符合預(yù)期。將酶切陽(yáng)顯示 siat7e 基因序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)序列相符（測(cè)序

圖 1.3 MDCK 細(xì)胞在不同濃度博來霉素作用下的生存曲線 細(xì)胞電轉(zhuǎn) pcDNA3.1-siat7e/Zeocin 質(zhì)粒后，通過電轉(zhuǎn)儀器 GenePuls據(jù)相似細(xì)胞系非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）的電轉(zhuǎn)條件，選擇指、4.0×106cells/pulse 條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。本研究使用 pcDNA3.1照進(jìn)行電轉(zhuǎn)，篩選指數(shù)波電轉(zhuǎn)時(shí)電壓和電容條件。電壓條件篩選ro 細(xì)胞電轉(zhuǎn)條件，設(shè)置電容為 350μF，探索 MDCK 細(xì)胞在0V、300V、350 和 400V 時(shí)的電轉(zhuǎn)效果。結(jié)果如圖 1.4 所示雖然細(xì)胞存活率最高，貼壁細(xì)胞最多，但是成功表達(dá) EGF壓為 250V 時(shí)，成功轉(zhuǎn)入 EGFP 質(zhì)粒并發(fā)出熒光的細(xì)胞最
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3 張啟龍;陳小云;王棟;;共表達(dá)siat7e和st3galⅠ基因MDCK細(xì)胞株的建立[J];中國(guó)獸藥雜志;2014年03期

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4 張啟龍;穩(wěn)定表達(dá)siat7e和st3galI基因MDCK細(xì)胞株的建立[D];中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2014年

本文編號(hào)：2871946